SIRT1在血管平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜形成中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、新生內(nèi)膜形成與血管重塑密切相關(guān)，主要包括血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡以及基質(zhì)成分合成、降解及重新排列等過程。過度的血管平滑肌細(xì)胞增殖是動(dòng)脈粥樣硬化、肺動(dòng)脈高壓、系統(tǒng)性高血壓、腹主動(dòng)脈瘤及經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)后再狹窄等心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。細(xì)胞增殖主要通過以下三種蛋白進(jìn)行調(diào)控：周期蛋白依賴性蛋白激酶(Cyclin-dependentkinase，CDK)，周期蛋白(Cyclin)，周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子(Cyclin-dep

2、endentkinaseinhibitor，CKI)。其中CyclinD1在細(xì)胞周期中最早被合成，于G1中期到達(dá)高峰，并與CDK4/CDK6形成復(fù)合物，對(duì)決定G1/S期轉(zhuǎn)換的限制點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控。CyclinD1主要有轉(zhuǎn)錄水平及泛素化降解途徑的調(diào)控，在生長因子刺激下，多種轉(zhuǎn)錄因子如：AP-1(activatorprotein-l)，NF-κB(nuclearfactor-κB)，SP1等激活CyclinD1，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控CyclinD1的表

3、達(dá)，其中AP-1對(duì)其的調(diào)控研究最多。
　　 人類SIRT1(SIRTuin1)是NAD+依賴的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，在各物種之間呈現(xiàn)高度的保守性，在7個(gè)SIRT成員中與酵母Sir2(silenceinformationregulator2)的同源性最高。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1能夠去乙?；M蛋白(H3，H4)和多種轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子，包括MyoD、p300、PGC-1α、PPARγ、NF-κB、Ku70、p53、FOXO

4、、E2F1等，在胚胎發(fā)育、組織分化、代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)和抵抗應(yīng)激方面發(fā)揮重要的作用。在多種細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1還能夠直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖。因此我們?cè)O(shè)想：在平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)SIRT1能夠抑制細(xì)胞增殖，從而對(duì)抗血管增殖性疾病的增殖。
　　 本研究首先應(yīng)用RT-PCR和Westernblot檢測(cè)了SIRT1在血清處理的血管平滑肌細(xì)胞和結(jié)扎后的頸總動(dòng)脈中的表達(dá)變化。隨后我們應(yīng)用RT-PCR、Souther

5、nblot、Westernblot、免疫組化等方法對(duì)平滑肌特異性SIRT1轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行鑒定，應(yīng)用小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型，采用HE染色、免疫組化、Masson染色、TUNEL染色等方法觀察轉(zhuǎn)基因鼠新生內(nèi)膜形成，血管平滑肌細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及動(dòng)脈中細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步通過H3-TdR、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SIRT1在體外對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。隨后，通過Westernblot、RT-PCR觀察在基礎(chǔ)水平和血清誘導(dǎo)下，過表達(dá)和干擾SIRT

6、1對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的影響；用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)對(duì)AP-1下游基因CyclinD1活性的影響；ChIP檢測(cè)SIRT1以及AP-1兩個(gè)亞基c-Fos/c-Jun在CyclinD1啟動(dòng)子上的募集。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)血清處理的血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)先升高，最后表達(dá)顯著降低，小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型中SIRT1表達(dá)隨新生內(nèi)膜形成短暫的升高后，顯著降低。實(shí)驗(yàn)表明SIRT1轉(zhuǎn)基因鼠可以抑制由頸總動(dòng)脈結(jié)扎所引起的新生內(nèi)膜形成，并且可

7、以減少細(xì)胞外基質(zhì)，但血管平滑肌細(xì)胞凋亡沒有顯著變化。腺病毒介導(dǎo)的SIRT1過表達(dá)可以抑制基礎(chǔ)水平和血清誘導(dǎo)的原代血管平滑肌細(xì)胞增殖，并使其血清誘導(dǎo)的原代血管平滑肌細(xì)胞阻滯在G1期。SIRT1在體內(nèi)外抑制G1期開關(guān)分子CyclinD1的表達(dá)，進(jìn)一步研究表明SIRT1在血管平滑肌細(xì)胞中結(jié)合c-Fos/c-Jun并抑制其在CyclinD1啟動(dòng)子上的募集，這可能是導(dǎo)致SIRT1抑制CyclinD1表達(dá)變化的分子基礎(chǔ)。
　　 我們的研究發(fā)

8、現(xiàn)小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型中SIRT1表達(dá)隨新生內(nèi)膜形成降低；SIRT1在體內(nèi)也可以降低CyclinD1的表達(dá)，并可能由此抑制新生內(nèi)膜形成。在血管平滑肌細(xì)胞中，SIRT1通過抑制c-Fos/c-Jun在CyclinD1啟動(dòng)子上的募集，從而降低CyclinD1的表達(dá)，使血管平滑肌細(xì)胞阻滯在G1期，并進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖。因此，SIRT1是調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖的重要基因，提高SIRT1的表達(dá)可以作為抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜形成，影