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文檔簡介
1、目的:本課題旨在觀察鈉氫交換體(Na+/H+ exchanger, NHE1)在高鹽誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖中的表達(dá),并初步探討其在高鹽誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖中作用。
方法:(1)鹽濃度、NHE1阻斷劑(Amiloride)濃度及作用時(shí)間的確定:取大鼠腹主動(dòng)脈采用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC),實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Na+濃度139mmol/L),高鹽組(Na+濃度159mmol/L),高鹽+阻斷劑組( Na+濃度
2、159mmol/l+Amiloride濃度10μM、20μM、30μM、40μM)。利用MTT比色法檢測不同濃度的Amiloride對(duì)高鹽干預(yù)的VSMCs增殖的影響,以確定Amiloride的最佳干預(yù)濃度。(2)效應(yīng)和機(jī)制分析:VSMCs無血清同步化24h后,實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Na+濃度139mmol/L),對(duì)照+阻斷劑組(Na+濃度139mmol/L+Amiloride濃度30μM),高鹽組(Na+濃度159mmol/L),高鹽+阻斷劑
3、組(Na+濃度159mmol/l+Amiloride濃度30μM)繼續(xù)培養(yǎng)72h后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):超微量Ca2+-ATPase測試試劑盒測定細(xì)胞膜鈣泵活性;細(xì)胞免疫熒光、real-time PCR及Western Blot檢測大鼠VSMC中NHE1、NCX-1、PMCA4基因與蛋白表達(dá),應(yīng)用比率熒光法檢測各組VSMC內(nèi)鈣離子的濃度及細(xì)胞內(nèi)pH值。
結(jié)果:MTT法顯示高鹽+阻斷劑組(Amiloride濃度為30μM)增殖能力較高鹽
4、組明顯減弱。與對(duì)照組比較,高鹽組NHE1、NCX-1、PCNA蛋白表達(dá)增加,PMCA4蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及 pH值明顯增加,(P﹤0.05)。同時(shí),NHE1、NCX-1 mRNA表達(dá)增加(P﹤0.05),PMCA4 mRNA表達(dá)無明顯差別(P﹥0.05);與高鹽組相比,高鹽+阻斷劑組NHE1、NCX-1、PCNA蛋白以及NHE1、NCX-1 mRNA表達(dá)下調(diào)(P﹤0.05),PMCA4蛋白和mRNA表達(dá)無明顯差別(P﹥0.0
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