新型色酮小分子化合物靶向端粒全酶核心成分Dyskerin誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡：設(shè)計(jì)合成及活性評(píng)價(jià).pdf

1、端粒酶的上調(diào)和激活在大多數(shù)腫瘤類別中被發(fā)現(xiàn)并且可以誘導(dǎo)正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，其在腫瘤進(jìn)展中的重要作用受到廣泛關(guān)注。端粒酶由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT、端粒酶RNA組分TERC和其他結(jié)合蛋白組成，他們共同參與端粒酶復(fù)合體的活化，在這些結(jié)合蛋白中的Dyskerin扮演了一個(gè)關(guān)鍵角色。Dyskerin的過(guò)表達(dá)已被證實(shí)在多種腫瘤進(jìn)程中起到重要作用并與不良預(yù)后有關(guān)。
　　目前的研究表明Dyskerin同時(shí)影響核糖體生物合成和端粒酶復(fù)合體的穩(wěn)定。一

2、方面Dyskerin活性的減低降低TERC水平并誘導(dǎo)端?？s短；另一方面，Dyskerin功能的缺失會(huì)改變抗凋亡因子比如bcl-2和bcl-xl的信使RNA的轉(zhuǎn)錄和修飾。這些生物效應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。另外，還有其他相關(guān)研究指出該基因在核質(zhì)穿梭、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞粘附中扮演重要角色?；贒yskerin同時(shí)在細(xì)胞和機(jī)體的生理進(jìn)程中起到的重要作用，靶向這些生理進(jìn)程已經(jīng)被探索作為新藥開發(fā)的作用靶點(diǎn)，以期望提高選擇性并優(yōu)先殺死腫瘤

3、細(xì)胞。
　　目的：
　　基于國(guó)內(nèi)外研究和實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)積累，借助計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，設(shè)計(jì)合成靶向Dyskerin的色酮小分子化合物并進(jìn)行活性評(píng)價(jià)和初步的作用機(jī)制研究。
　　內(nèi)容和方法：
　　1、基于Dyskerin的蛋白結(jié)構(gòu)分析其可能的活性位點(diǎn)，通過(guò)分子對(duì)接和虛擬篩選，遴選出高活性的目的蛋白小分子抑制劑的骨架結(jié)構(gòu)，并通過(guò)化學(xué)合成的手段合成出一系列的目標(biāo)化合物。
　　2、對(duì)合成出的一系列化合物進(jìn)行抗腫瘤活性評(píng)

4、價(jià)，以篩選出高活性低毒性的小分子化合物。主要方法有細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT法）、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡（Annexin V-FITC/PI雙染）、檢測(cè)線粒體膜電位MPP（JC-1法）、檢測(cè)細(xì)胞周期（PI單染）。
　　3、挑選高活性的小分子化合物進(jìn)行初步的作用機(jī)制研究?；诨钚栽u(píng)價(jià)的相關(guān)結(jié)果和目標(biāo)靶點(diǎn)的功能，通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其凋亡和周期阻滯相關(guān)蛋白，探尋其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的通路機(jī)制。
　　4、新型小分子化合物的靶點(diǎn)研究。研

5、究小分子化合物是否通過(guò)抑制設(shè)想的靶蛋白發(fā)揮作用。主要方法是檢測(cè)目標(biāo)蛋白及其結(jié)合蛋白的表達(dá)和調(diào)控情況并通過(guò)免疫熒光技術(shù)進(jìn)行目的蛋白的定位
　　5、TRAP-PCR-ELISA法檢測(cè)小分子化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　借助計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，用化學(xué)合成的手段合成了一系列的小分子化合物，通過(guò)活性評(píng)價(jià)得到數(shù)個(gè)高抗腫瘤活性低毒性的色酮小分子化合物。其中化合物8的效果較好，我們挑選其進(jìn)行了

6、靶點(diǎn)和作用機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物8能顯著降低細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。其誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G2/M期、破壞線粒體功能、引起嚴(yán)重的DNA損傷等途徑實(shí)現(xiàn)的。靶點(diǎn)研究表明，化合物8作用于胃癌細(xì)胞可以顯著抑制目的蛋白Dyskerin的表達(dá)并同時(shí)抑制hTERT蛋白，導(dǎo)致端粒酶活性的顯著下降。以上結(jié)果表明化合物8是一個(gè)高效的Dyskerin抑制劑并具有優(yōu)越的體外抗腫瘤活性。
　　結(jié)論：
　　Dyske