全外顯子組測序鑒定RP致病基因EYS新突變及PCG候選致病基因功能研究.pdf

1、遺傳疾病是指遺傳物質改變而導致的疾病，且能由親代傳遞于后代。人們已經發(fā)現(xiàn)多種眼睛疾病與遺傳相關如原發(fā)性先天性青光眼（Primary congential glaucoma， PCG；OMIM231300）、視網膜母細胞瘤、視網膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP；OMIM226800）、先天性紅綠色盲、高度近視等。其中，PCG和 RP是兩種非常嚴重的遺傳致盲性疾病。目前，雖然有不少RP和PCG的致病基因及突變位點得

2、到了鑒定，但這些基因及突變并不能完全解釋所有患者的患病，提示仍然有新的致病基因或突變位點存在。
　　定位克隆、功能克隆等方式是發(fā)現(xiàn)這些疾病致病基因的重要手段。但其具有一定局限性，例如某些疾病家系信息難以收集，疾病的生理生化機制不明等。隨著測序技術的不斷發(fā)展，全外顯子組測序（Whole-exomesequencing，WES）技術在遺傳疾病研究中的應用越來越廣泛。該技術利用序列捕獲方法將全基因組范圍外顯子區(qū)域的DNA捕獲并富集后進行

3、高通量測序。另外，該技術還具備靈敏度高，花費低，能夠同時發(fā)現(xiàn)已知致病基因和未知致病基因突變等優(yōu)勢。
　　本課題組采用WES技術對RP和PCG患者進行測序，以期發(fā)現(xiàn)新的致病基因或新的突變位點，并進一步利用細胞生物學和動物模型等初步功能研究來驗證新的致病基因的可靠性。結果顯示，
　　1）在印度 RP人群中，我們發(fā)現(xiàn)了已知致病基因 EYS的新突變。這些突變包括三對復合性雜合突變 c.[8422G>A];[7868G>A]、c.[4

4、606C>G];[5038A>G]和 c.[1418G>T];[2971C>T]，7個純合突變c.[1872G>A]、c.[8455delA]、c.[9059T>C]、c.[8388C>A]、c.[7187G>C]、c.[2259+1G>A]和c.[3024C>A]。
　　2）對于課題組前期鑒定的PCG新候選基因P-X，我們進行了初步的功能學研究。生物信息學預測結果顯示，該基因突變位點 c.C58T（p.R20X）和c.A232G

5、（p.I78V）的氨基酸殘基位于蛋白β折疊區(qū)；并且前者可導致截斷蛋白的產生，后者突變氨基酸殘基位于β-折疊與α-螺旋連接處，而該區(qū)域位于P-X蛋白GTP酶活性區(qū)；在mRNA水平，該基因在人和小鼠視網膜均有表達，此外在小鼠的視網膜色素上皮、虹膜、睫狀體、視杯、晶狀體和角膜都也有表達。在蛋白水平上，通過組織免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，該基因在人視網膜感光細胞及神經節(jié)細胞有較強表達；在小鼠視網膜、房角，虹膜等部位有較強表達。生物細胞學實驗結果顯示，該蛋

6、白主要表達于細胞漿；并且通過構建突變型質粒，我們成功地驗證了突變位點對蛋白表達的影響。其中，突變位點c.[58C>T]使得蛋白表達缺失，而c.[232A>G]突變則出現(xiàn)蛋白在細胞內的分布出現(xiàn)異常。這些結果與生物信息學預測結果一致。
　　3）對于基因P-X體內功能的研究，我們在斑馬魚中，通過顯微注射Morpholino（MO）阻抑P-X蛋白表達，發(fā)現(xiàn)斑馬魚眼睛的發(fā)育受到了影響，表現(xiàn)為眼睛變小，神經節(jié)細胞、視桿細胞、視錐細胞變少，分布

7、異常。為了檢測其原因，我們通過Tunel方法標記凋亡細胞，磷酸化組蛋白抗體標記增殖細胞，結果發(fā)現(xiàn)阻抑 P-X蛋白表達的斑馬魚視網膜細胞增殖異常，而凋亡與正常對照無差異，提示 P-X可能通過影響視網膜細胞的增殖而參與了PCG的發(fā)病。然而，其具體機制有待進一步研究。
　　綜上所述，1）我們通過全外顯子測序技術，發(fā)現(xiàn)了印度RP患者已知致病基因 EYS的新突變位點包括三對復合性雜合突變，7個純合突變，豐富了RP致病基因突變譜；2）對前期發(fā)