全基因組外顯子測(cè)序搜尋一例家族性進(jìn)行性色素沉著和色素減退家系的致病基因.pdf

1、研究背景：家族性進(jìn)行性色素沉著和色素減退癥（ familial progressive hyperpigmentation and hypopigmentation, FPHH）是一種外顯率降低的常染色體顯性遺傳性色素異常性皮膚病，于1971年chernosky等人首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)。臨床特征為彌漫性不同程度的色素沉著、咖啡斑、較大桉樹(shù)葉狀色素減退斑，通常累及面、頸、軀干和四肢?；颊叱錾鷷r(shí)或出生幾月后發(fā)病，皮損大小及數(shù)量隨年齡增長(zhǎng)而逐漸增加。

2、有報(bào)道部分家系中患者存在智力缺陷和生長(zhǎng)發(fā)育障礙。2011年Amyere等首次提出FPHH這個(gè)概念，并對(duì)7例伴雀斑樣痣的FPHH家系（5例德國(guó)家系、1例美國(guó)家系和1例丹麥家系）進(jìn)行全基因組參數(shù)與非參數(shù)多點(diǎn)連鎖分析和單倍型分析，將其致病基因定位于染色體12q21.12-q22區(qū)域；其中4例家系中檢測(cè)到 KITLG基因3種突變 c.107A>G（p.Asn36Ser）、c.98T>C（ p.Val33Ala）、c.100A>C（p.Thr34

3、Pro）。
　　目的：（1）對(duì)1例常染色體顯性遺傳的漢族家族性進(jìn)行性色素沉著和色素減退進(jìn)行臨床研究，探討FPHH的臨床特點(diǎn)。（2）進(jìn)行KITLG基因突變檢測(cè)，探討是否由該基因引起該家系發(fā)病。（3）應(yīng)用中華芯片進(jìn)行連鎖分析，確定致病基因的染色體定位。（4）選擇該家系中1個(gè)患者和2個(gè)正常個(gè)體進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序，以搜尋該家系的致病基因，從而進(jìn)一步闡明該家系發(fā)病分子遺傳學(xué)機(jī)制。方法(1)對(duì)該家系中的所有患者進(jìn)行遺傳流行病學(xué)調(diào)查和體格檢

4、查。（2）采集家系中的14個(gè)樣本（8例患者，6例正常對(duì)照）和200例家系外無(wú)血緣關(guān)系的正常個(gè)體對(duì)照外周抗凝血樣本，采用Qiagen試劑盒提取所有樣本的基因組DNA；（3）應(yīng)用Primer Premier5.0軟件對(duì)已報(bào)道的FPHH致病基因KITLG基因的全部外顯子及其倆側(cè)的側(cè)翼序列區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，應(yīng)用降落式 PCR擴(kuò)增目的片段后，應(yīng)用 ABI3730XL測(cè)序儀將所擴(kuò)增目的片段進(jìn)行 sanger直接測(cè)序驗(yàn)證有無(wú)致病突變。（4）使用Ill

5、umina中華芯片對(duì)獲得DNA樣本的家系中14名成員進(jìn)行基因分型，獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行家系連鎖定位分析，獲得一段連鎖區(qū)域。（5）HiSeq2500高通量測(cè)序儀對(duì)該家系2例正常對(duì)照（III:11，III:18）和1例患者（II:I0）進(jìn)行全基因外顯子測(cè)序，獲得數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)過(guò)濾、比對(duì)后，結(jié)果與連鎖定位區(qū)域進(jìn)行比對(duì)，選擇處連鎖定位區(qū)域內(nèi)的變異位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。（6）如果未在連鎖定位區(qū)域內(nèi)找到變異位點(diǎn)或未在外顯子組區(qū)域驗(yàn)證出基因型－表型共分離

6、位點(diǎn)，應(yīng)將搜索范圍擴(kuò)大到整個(gè)外顯子組，通過(guò)功能預(yù)測(cè)軟件如SIFT、PolyPhen選擇可能有害變異位點(diǎn)，應(yīng)用Sanger測(cè)序驗(yàn)證。
　　結(jié)果：（1）常染色體顯性FPHH的臨床特征出生時(shí)或出生幾月后發(fā)病，皮損表現(xiàn)為彌漫性不同程度的色素沉著、咖啡斑、較大桉樹(shù)葉狀色素減退斑，通常累及面、頸、軀干和四肢，且皮損大小及數(shù)量隨年齡增長(zhǎng)而逐漸增加。（2）Sanger測(cè)序結(jié)果顯示KITLG基因的所有外顯子和側(cè)翼序列未發(fā)現(xiàn)致病性突變。（3）Illu

7、mina中華芯片連鎖分析未發(fā)現(xiàn)與該家系相連鎖的染色體區(qū)域；（4）家系中的2例正常對(duì)照（III:11，III:18）和1例病例（II:I0）進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序，所獲得的全部數(shù)據(jù)在dbSNP，Hapmap8等數(shù)據(jù)以及病例對(duì)照之間進(jìn)行篩查，最終得到186個(gè)SNP位點(diǎn)和31個(gè)Indels變異。使用SIFT、Polyphen軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得22個(gè)可能有害的變異位點(diǎn)，Sanger測(cè)序未發(fā)現(xiàn)致病性突變。
　　結(jié)論：（1）在該FPHH家系中