Gadd45b在缺血性腦卒中和卒中后腦可塑性中的作用.pdf

1、目的：生長阻斷及 DNA損傷誘導(dǎo)因子45b（Growth arrest and DNA-damage inducible protein beta，Gadd45b）屬于Gadd45家族，被證實(shí)與神經(jīng)元活動有關(guān)，這與神經(jīng)的發(fā)生密切的相關(guān)。大鼠的腦缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo) Gadd45b在蛋白和核酸水平的表達(dá)，Gadd45b介導(dǎo)了神經(jīng)元的凋亡，可能與軸突可塑性和卒中后腦康復(fù)有關(guān)。細(xì)胞的死亡方式包括了凋亡、自噬和壞死。自噬性細(xì)胞死亡作為 II型

2、程序性細(xì)胞死亡，被證實(shí)參與了腦缺血再灌注損傷這一病理過程。然而，在此病理過程中 Gadd45b對自噬的作用并不清楚。此外，在腦缺血中， Gadd45b可以促進(jìn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（ brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)，與軸突的可塑性而相關(guān)，Gadd45b在腦缺血中可能起著促進(jìn)康復(fù)的作用。然而，在腦缺血病理過程中， Gadd45b表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。泛素-蛋白酶系統(tǒng)（Ubiquiti

3、n-proteasome system，UPS）廣泛調(diào)控了細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解。Gadd45的表達(dá)受到了泛素化方式的調(diào)控。但是，腦缺血再灌注損傷如何誘導(dǎo) Gadd45b表達(dá)及所涉及的具體機(jī)制也不清楚。本研究以進(jìn)一步探討和分析在腦缺血再灌注損傷的病理過程中 Gadd45b對自噬的作用和可能的作用機(jī)制，以及泛素化系統(tǒng)Huwe1對Gadd45b的作用，以及兩者在卒中后腦可塑性中的作用機(jī)制。
　　方法：采用大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)，并予以缺氧缺

4、糖/再灌注處理（oxygen-glucose deprivation and reperfusion, OGD/R），即OGD3 h和再灌注0h、6h、24h、48h、72h和120h。CCK-8和LDH試劑盒用于檢測皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活性和損傷情況。構(gòu)建慢病毒shRNA-Gadd45b沉默Gadd45b的表達(dá)，利用蛋白印跡技術(shù)檢測自噬分子（ATG5、LC3、Beclin-1、ATG7、ATG3）、凋亡通路分子（Bax、Bcl-2、Cle

5、aved caspase3、p53）以及JNK/p38信號通路的表達(dá)變化。同時，給予自噬抑制劑或 JNK/p38通路抑制劑共處理，檢測相關(guān)分子的蛋白表達(dá)變化情況，并利用TUNEL技術(shù)檢測皮層神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況。利用神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj1和LC3B免疫熒光染色雙標(biāo)技術(shù)檢測神經(jīng)元的軸突損傷。此外，構(gòu)建慢病毒shRNA-Huwe1沉默Huwe1的表達(dá)變化，采用CO-IP檢測Huwe1和Gadd45b的相互作用，進(jìn)行CHX處理檢測Huwe1對

6、Gadd45b蛋白穩(wěn)定性的分析，采用 BSP檢測 Huwe1和Gadd45b對BDNF IXa甲基化的作用，采用western blot技術(shù)檢測Huwe1和Gadd45b對BDNF及其受體TrkB和p75NTR和下游效應(yīng)分子的影響。
　　結(jié)果：在OGD/R處理神經(jīng)元細(xì)胞后，皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活性降低，隨著再灌注時間的延長而逐漸降低。Gadd45b在OGD/R24 h時表達(dá)最高，給予慢病毒shRNA沉默Gadd45b后，Gadd45b

7、在再灌注24 h時表達(dá)明顯的降低，增加了自噬通路的信號分子（Beclin-1、ATG5、ATG7和ATG3）、LC3 II/LC3 I的比值和凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase3的表達(dá)，但是降低了抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達(dá)。與此同時，慢病毒shRNA-Gadd45b和自噬通路抑制劑3-MA或Wortmannin共處理后，可部分抑制 LC3 II/LC3 I的比例，輕微緩解了神經(jīng)元的凋亡。沉默Gadd45b表達(dá)后，自噬相關(guān)通

8、路p-p38磷酸化水平降低，而凋亡相關(guān)通路p-JNK磷酸化水平增加。給予慢病毒shRNA-Gadd45b和p38通路抑制劑共處理后則明顯誘導(dǎo)了自噬，而給予慢病毒 shRNA-Gadd45b和JNK通路抑制劑共處理后則明緩解了細(xì)胞凋亡。OGD/R24 h后，沉默Huwe1表達(dá)后明顯增加了Gadd45b和BDNF的表達(dá)。CO-IP結(jié)果表明Huwe1和Gadd45b存在相互作用。通過CHX處理后抑制了內(nèi)源性的Gadd45b的表達(dá)，CHX和慢病

9、毒 shRNA-Huwe1共處理后則增加了Gadd45b的表達(dá)。慢病毒shRNA-Gadd45b處理后降低了BDNF和下游效應(yīng)分子的表達(dá)，而慢病毒 shRNA-Huwe1處理后增加了 BDNF和下游效應(yīng)分子表達(dá)。沉默Huwe1表達(dá)后降低了BDNF IXa第五個CpG島甲基化水平，而沉默Gadd45b表達(dá)后則增加了BDNF IXa第四個CpG島甲基化水平。
　　結(jié)論：在皮層神經(jīng)元OGD/R的病理過程中Gadd45b調(diào)節(jié)了凋亡和自噬，