永生化人肝星狀細胞系的建立及其對肝細胞功能與肝祖細胞分化的影響.pdf

1、研究背景:
　　 各種原因引起的肝衰竭病死率高達70％～80％。以肝細胞為生物活性成分的生物型人工肝(bioartificial liver，BAL)成為肝衰竭治療研究的熱點和發(fā)展方向?；谠烁渭毎?、原代豬肝細胞、C3A肝腫瘤細胞的三種類型肝細胞的BAL臨床試驗治療顯示，BAL具有很好的療效和應(yīng)用前景。但是，肝細胞源的短缺等問題，依然阻礙著BAL的臨床應(yīng)用和發(fā)展。
　　 肝臟干細胞可誘導(dǎo)分化為功能成熟的肝細胞，被認為

2、是非常有前景的細胞源。目前，肝臟干細胞在體外誘導(dǎo)分化是受到多種因素影響和調(diào)控，分化后的肝細胞尚難達到生物人工肝臨床治療的數(shù)量。因此，需要進一步探索肝臟干細胞的規(guī)模化培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的新方式和新方法。
　　 肝細胞永生化是解決肝細胞來源困難的重要可行性途徑之一。然而，永生化人肝細胞的基因表達和細胞功能，與原代人肝細胞功能存在一定的差異。因此，必須在解決肝細胞數(shù)量的同時，需要進一步提高永生化人肝細胞的分化程度和細胞功能。
　　

3、 細胞與細胞間相互作用在保持和促進細胞功能中起著非常重要作用。在各種共培養(yǎng)體系中，肝細胞與肝非實質(zhì)細胞之間的相互作用為肝細胞生長提供了微環(huán)境，有助于肝細胞保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細胞功能。肝星狀細胞是肝臟中非常重要的非實質(zhì)細胞。然而，原代肝星狀細胞存在著分離繁瑣，分離成本較高，容易失去生物學(xué)特性和功能等問題。
　　 綜上所述，我們從以下幾個方面進行研究，建立高活性和功能的永生化人肝星狀細胞系，探索永生化人肝星狀細胞與永生化人肝細胞共培養(yǎng)

4、對肝細胞功能的影響，以及探索永生化人肝星狀細胞對肝祖細胞向肝細胞分化的影響。為優(yōu)化和完善永生化人肝細胞培養(yǎng)的微環(huán)境和建立肝祖細胞向肝細胞分化的新方法提供實驗依據(jù)，將為生物型人工肝提供更高質(zhì)量的肝細胞奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分永生化人肝星狀細胞系的建立及其鑒定
　　 目的:建立高活性和功能的永生化人肝星狀細胞系，為肝非實質(zhì)細胞與肝細胞、肝祖細胞共培養(yǎng)研究提供理想的細胞模型。
　　 方法:采用SV40LT重組反轉(zhuǎn)錄病

5、毒感染原代人肝星狀細胞，獲得永生化人肝星狀細胞系。采用電鏡技術(shù)、RT-PCR等分析永生化人肝星狀細胞的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性和功能等。
　　 結(jié)果:建立一株永生化人肝星狀細胞系，命名為HSC-Li。該細胞系具有典型的肝星狀細胞形態(tài)學(xué)特征;HSC-Li細胞的Ⅰ、Ⅱ型膠原、HGF等mRNA表達為陽性;HSC-Li細胞的α-SMA、Vimentin、GFAP和SV40 LT蛋白表達為陽性。HSC-Li細胞分泌VEGF、HGF、IL-6、T

6、GF-betal等多種細胞因子和炎癥因子。
　　 結(jié)論:建立了一株永生化人肝星狀細胞系HSC-Li，該細胞系具有人肝星狀細胞的生物學(xué)特性和功能;可為肝細胞與肝星狀細胞、肝祖細胞與肝星狀細胞共培養(yǎng)研究提供理想的細胞模型。
　　 第二部分永生化人肝星狀細胞與永生化人肝細胞共培養(yǎng)對肝細胞功能的影響
　　 目的:探索永生化人肝星狀細胞與永生化人肝細胞共培養(yǎng)對永生化人肝細胞功能的影響;為優(yōu)化和完善永生化人肝細胞培養(yǎng)的微環(huán)境

7、提供實驗依據(jù)。
　　 方法:首先采用SV40LT重組反轉(zhuǎn)錄病毒感染原代人肝細胞，獲得一株永生化人肝細胞系;通過直接接觸共培養(yǎng)、間接接觸共培養(yǎng)方式進行永生化人肝細胞與永生化人肝星狀細胞共培養(yǎng)研究，測定永生化人肝細胞共培養(yǎng)24h、48h、72h后ALB、CYP3A5、CYP2E1、UGT2b7等基因的表達水平，以及測定CYP1A2活力。
　　 結(jié)果:建立了一株永生化人肝細胞系HepLi5，HepLi5細胞的ALB、GS、CY

8、P2E1、CYP3A5等基因的mRNA表達均為陽性，具有分泌白蛋白等原代人肝細胞的生物學(xué)特性和功能。HSC-Li細胞與HepLi5細胞直接接觸和間接接觸共培養(yǎng)研究結(jié)果顯示，HepLi5細胞在共培養(yǎng)24h、48h、72h后ALB、CYP3A5、CYP2E1、UGT2b7等基因表達顯著增強，以及CYP1A2活力顯著增強。與單獨培養(yǎng)組相比較，直接接觸共培養(yǎng)方式和間接接觸共培養(yǎng)方式均顯著增強肝細胞基因表達和功能。
　　 結(jié)論:建立了一株

9、永生化人肝細胞系HepLi5，HepLi5細胞具有分泌白蛋白等原代人肝細胞的生物學(xué)特性和功能。直接接觸共培養(yǎng)和間接接觸共培養(yǎng)方式均可顯著增強HepLi5細胞的基因表達和細胞功能。為優(yōu)化和完善永生化人肝細胞培養(yǎng)的微環(huán)境提供實驗依據(jù)，將為生物型人工肝提供更高質(zhì)量的肝細胞奠定基礎(chǔ)。
　　 第三部分永生化人肝星狀細胞對肝祖細胞向肝細胞分化的影響
　　 目的:探索永生化人肝星狀細胞對肝祖細胞BMEL-TAT分化為肝細胞的影響;為建

10、立肝祖細胞向肝細胞分化的新方法提供實驗依據(jù)。
　　 方法:通過永生化人肝星狀細胞與肝祖細胞間接接觸共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)肝祖細胞分化為肝細胞，檢測肝祖細胞BMEL-TAT共培養(yǎng)前、后細胞表型和功能。
　　 結(jié)果:HSC-Li肝星狀細胞與肝祖細胞BMEL-TAT間接接觸共培養(yǎng)方式可以誘導(dǎo)肝祖細胞分化為功能成熟的肝細胞。以單獨培養(yǎng)BMEL-TAT細胞作為對照，與HSC-Li細胞共培養(yǎng)3天后，BMEL-TAT細胞在細胞形態(tài)上開始向肝樣

11、細胞轉(zhuǎn)變;與HSC-Li細胞共培養(yǎng)7、14、21天后，BMEL-TAT細胞的ALB、CK18、TAT、G6P等基因表達逐漸增強;細胞免疫熒光染色顯示:共培養(yǎng)21天后BMEL-TAT細胞的ALB、CK18表達顯著增強，CK19、AFP表達下降。共培養(yǎng)21天后BMEL-TAT細胞的X-gal染色、PAS染色和DiI-LDL吸收實驗均為陽性，以及CYP1A2活力和尿素合成也顯著增強。
　　 結(jié)論:建立了肝祖細胞向肝細胞分化的新方法;永