永生化人肝星狀細(xì)胞系的建立及其對肝細(xì)胞功能與肝祖細(xì)胞分化的影響.pdf

1、研究背景:
　　 各種原因引起的肝衰竭病死率高達(dá)70％～80％。以肝細(xì)胞為生物活性成分的生物型人工肝(bioartificial liver，BAL)成為肝衰竭治療研究的熱點(diǎn)和發(fā)展方向?；谠烁渭?xì)胞、原代豬肝細(xì)胞、C3A肝腫瘤細(xì)胞的三種類型肝細(xì)胞的BAL臨床試驗(yàn)治療顯示，BAL具有很好的療效和應(yīng)用前景。但是，肝細(xì)胞源的短缺等問題，依然阻礙著BAL的臨床應(yīng)用和發(fā)展。
　　 肝臟干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為功能成熟的肝細(xì)胞，被認(rèn)為

2、是非常有前景的細(xì)胞源。目前，肝臟干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化是受到多種因素影響和調(diào)控，分化后的肝細(xì)胞尚難達(dá)到生物人工肝臨床治療的數(shù)量。因此，需要進(jìn)一步探索肝臟干細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)和誘導(dǎo)分化的新方式和新方法。
　　 肝細(xì)胞永生化是解決肝細(xì)胞來源困難的重要可行性途徑之一。然而，永生化人肝細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞功能，與原代人肝細(xì)胞功能存在一定的差異。因此，必須在解決肝細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)，需要進(jìn)一步提高永生化人肝細(xì)胞的分化程度和細(xì)胞功能。
　　

3、 細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用在保持和促進(jìn)細(xì)胞功能中起著非常重要作用。在各種共培養(yǎng)體系中，肝細(xì)胞與肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用為肝細(xì)胞生長提供了微環(huán)境，有助于肝細(xì)胞保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞功能。肝星狀細(xì)胞是肝臟中非常重要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。然而，原代肝星狀細(xì)胞存在著分離繁瑣，分離成本較高，容易失去生物學(xué)特性和功能等問題。
　　 綜上所述，我們從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究，建立高活性和功能的永生化人肝星狀細(xì)胞系，探索永生化人肝星狀細(xì)胞與永生化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)

4、對肝細(xì)胞功能的影響，以及探索永生化人肝星狀細(xì)胞對肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的影響。為優(yōu)化和完善永生化人肝細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境和建立肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，將為生物型人工肝提供更高質(zhì)量的肝細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分永生化人肝星狀細(xì)胞系的建立及其鑒定
　　 目的:建立高活性和功能的永生化人肝星狀細(xì)胞系，為肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞與肝細(xì)胞、肝祖細(xì)胞共培養(yǎng)研究提供理想的細(xì)胞模型。
　　 方法:采用SV40LT重組反轉(zhuǎn)錄病

5、毒感染原代人肝星狀細(xì)胞，獲得永生化人肝星狀細(xì)胞系。采用電鏡技術(shù)、RT-PCR等分析永生化人肝星狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性和功能等。
　　 結(jié)果:建立一株永生化人肝星狀細(xì)胞系，命名為HSC-Li。該細(xì)胞系具有典型的肝星狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征;HSC-Li細(xì)胞的Ⅰ、Ⅱ型膠原、HGF等mRNA表達(dá)為陽性;HSC-Li細(xì)胞的α-SMA、Vimentin、GFAP和SV40 LT蛋白表達(dá)為陽性。HSC-Li細(xì)胞分泌VEGF、HGF、IL-6、T

6、GF-betal等多種細(xì)胞因子和炎癥因子。
　　 結(jié)論:建立了一株永生化人肝星狀細(xì)胞系HSC-Li，該細(xì)胞系具有人肝星狀細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能;可為肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞、肝祖細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)研究提供理想的細(xì)胞模型。
　　 第二部分永生化人肝星狀細(xì)胞與永生化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)對肝細(xì)胞功能的影響
　　 目的:探索永生化人肝星狀細(xì)胞與永生化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)對永生化人肝細(xì)胞功能的影響;為優(yōu)化和完善永生化人肝細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境

7、提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:首先采用SV40LT重組反轉(zhuǎn)錄病毒感染原代人肝細(xì)胞，獲得一株永生化人肝細(xì)胞系;通過直接接觸共培養(yǎng)、間接接觸共培養(yǎng)方式進(jìn)行永生化人肝細(xì)胞與永生化人肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)研究，測定永生化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)24h、48h、72h后ALB、CYP3A5、CYP2E1、UGT2b7等基因的表達(dá)水平，以及測定CYP1A2活力。
　　 結(jié)果:建立了一株永生化人肝細(xì)胞系HepLi5，HepLi5細(xì)胞的ALB、GS、CY

8、P2E1、CYP3A5等基因的mRNA表達(dá)均為陽性，具有分泌白蛋白等原代人肝細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能。HSC-Li細(xì)胞與HepLi5細(xì)胞直接接觸和間接接觸共培養(yǎng)研究結(jié)果顯示，HepLi5細(xì)胞在共培養(yǎng)24h、48h、72h后ALB、CYP3A5、CYP2E1、UGT2b7等基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，以及CYP1A2活力顯著增強(qiáng)。與單獨(dú)培養(yǎng)組相比較，直接接觸共培養(yǎng)方式和間接接觸共培養(yǎng)方式均顯著增強(qiáng)肝細(xì)胞基因表達(dá)和功能。
　　 結(jié)論:建立了一株

9、永生化人肝細(xì)胞系HepLi5，HepLi5細(xì)胞具有分泌白蛋白等原代人肝細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能。直接接觸共培養(yǎng)和間接接觸共培養(yǎng)方式均可顯著增強(qiáng)HepLi5細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞功能。為優(yōu)化和完善永生化人肝細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，將為生物型人工肝提供更高質(zhì)量的肝細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　 第三部分永生化人肝星狀細(xì)胞對肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的影響
　　 目的:探索永生化人肝星狀細(xì)胞對肝祖細(xì)胞BMEL-TAT分化為肝細(xì)胞的影響;為建

10、立肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:通過永生化人肝星狀細(xì)胞與肝祖細(xì)胞間接接觸共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞分化為肝細(xì)胞，檢測肝祖細(xì)胞BMEL-TAT共培養(yǎng)前、后細(xì)胞表型和功能。
　　 結(jié)果:HSC-Li肝星狀細(xì)胞與肝祖細(xì)胞BMEL-TAT間接接觸共培養(yǎng)方式可以誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞分化為功能成熟的肝細(xì)胞。以單獨(dú)培養(yǎng)BMEL-TAT細(xì)胞作為對照，與HSC-Li細(xì)胞共培養(yǎng)3天后，BMEL-TAT細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)上開始向肝樣

11、細(xì)胞轉(zhuǎn)變;與HSC-Li細(xì)胞共培養(yǎng)7、14、21天后，BMEL-TAT細(xì)胞的ALB、CK18、TAT、G6P等基因表達(dá)逐漸增強(qiáng);細(xì)胞免疫熒光染色顯示:共培養(yǎng)21天后BMEL-TAT細(xì)胞的ALB、CK18表達(dá)顯著增強(qiáng)，CK19、AFP表達(dá)下降。共培養(yǎng)21天后BMEL-TAT細(xì)胞的X-gal染色、PAS染色和DiI-LDL吸收實(shí)驗(yàn)均為陽性，以及CYP1A2活力和尿素合成也顯著增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:建立了肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的新方法;永