廣西巴馬小型豬類Na_ve狀態(tài)iPSCs的初步研究.pdf

1、本研究以廣西巴馬小型豬的成纖維細胞(Porcine Fetal Fibroblasts，PFF)、骨髓間充質(zhì)細胞(Porcine Bone marrow Menenchymal Stem Cells，PBMSCs)和脂肪干細胞(Porcine Adipose-derived Stem Cells，PASCs)為材料，通過四環(huán)素(Doxycycline，DOX)誘導型慢病毒載體將Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nan

2、og導入不同種類細胞中，比較不同種類細胞和不同培養(yǎng)基條件下的重編程效率，并對獲得的類克隆進行生物學鑒定。同時，在培養(yǎng)基中添加p38和JNK通路抑制劑SB203580和SP600125，以期獲得原始態(tài)(Na(i)ve)的豬誘導多能干細胞(porcine induced PluripotentStem Cells，piPSCs)。研究結(jié)果總結(jié)如下。
　　1、廣西巴馬小型豬不同種類細胞和不同培養(yǎng)條件下重編程效率的比較。不同種類細胞經(jīng)過病

3、毒感染后，在人胚胎干細胞和誘導多能干細胞完全培養(yǎng)液即mTeSR培養(yǎng)條件下于感染后的D10-D12形成克隆，通過克隆形態(tài)觀測和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)染色計數(shù)，PBMSCs、PASCs、PFF的重編程效率分別為0.28％、0.25％、0.23％，PBMSCs顯著高于PFF，PASCs與PBMSCs、PFF之間無顯著性差異，但在mTeSR培養(yǎng)條件下未獲得穩(wěn)定傳代的細胞株。
　　為改進培養(yǎng)條件，比較了

4、PBMSCs在含bFGF、2i(PD0325901+CHIR99021)+Lif和2i+Lif+bFGF培養(yǎng)基的克隆形成效率，發(fā)現(xiàn)PBMSCs在bFGF、2i+Lif、2i+Lif+bFGF的重編程效率分別為1.12％、0.84％、1.07％，bFGF、2i+Lif+bFGF顯著高于2i+Lif組，bFGF和2i+Lif+bFGF組間差異不顯著。為了確認最佳傳代培養(yǎng)條件，分別挑取不同培養(yǎng)條件來源的PBMSCs-piPSCs克隆，使用相應

5、培養(yǎng)基繼續(xù)傳代培養(yǎng)，并進一步檢測其內(nèi)源性基因的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bFGF組克隆的內(nèi)源基因Oct4、Klf4的表達量最低，從P10開始逐漸凋亡分化;2i+Lif組的克隆突起感較強，但生長緩慢，從P6開始逐漸停止增殖;2i+Lif+bFGF組的克隆內(nèi)源基因Oct4、Klf4的表達量最高，傳至P15克隆形態(tài)仍未發(fā)生改變，增殖較快。綜合重編程效率、克隆傳代次數(shù)及內(nèi)源性基因的表達情況，2i+Lif+bFGF的培養(yǎng)條件對piPSCs克隆的獲得和傳

6、代培養(yǎng)具有較好的效果。
　　2、來自不同種類細胞的piPSCs的生物學特性鑒定。使用含2i+Lif+bFGF的培養(yǎng)條件獲得來源于PBMSCs、PASCs、PFF的iPSCs克隆，然后對其進行生物學特性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆呈堿性磷酸酶陽性;表達內(nèi)源多能性相關(guān)基因Oct4、Sox2及E-cadherin、Dnmt3b、GDF3，同時表達Primed和Na(i)ve狀態(tài)多能干細胞的候選標志基因FGF5和Klf4、Klf5。去掉培養(yǎng)基中的

7、DOX后，外源基因逐漸沉默，2i+Lif+bFGF的培養(yǎng)條件仍能持續(xù)傳代培養(yǎng)piPSCs，piPSCs的增殖速率要高于對應的體細胞，PBMSCs、PASCs、PFF來源iPSCs的群體倍增時間分別為0.95d、0.93d、0.97d。核型分析結(jié)果顯示:piPSCs核型正常率在70％以上，具有38條染色體;體外分化實驗表明，piPSCs可形成擬胚體(Embryiod body，EB)，并表達內(nèi)、中、外三胚層的標記性基因，具有體外分化潛能。

8、以上結(jié)果表明，不同種類細胞來源的piPSCs具有Primed和Na(i)ve狀態(tài)多能干細胞的特征。
　　3、SB203580和SP600125促進piPSCs向Na(i)ve狀態(tài)轉(zhuǎn)變的初步研究。在2i+Lif+bFGF的基礎(chǔ)上添加p38和JNK通路抑制劑SB203580和SP600125，以期獲得接近于Na(i)ve狀態(tài)的piPSCs。采用cck-8試劑盒檢測不同濃度SB203580、SP600125對PBMSCs增殖的影響，最終

9、采用5μM濃度的SB203580和SP600125用于后續(xù)實驗。SB203580和SP600125（簡稱2s）聯(lián)合2i+Lif+bFGF的培養(yǎng)條件，成功獲得來源于PBMSCs的2s-piPSCs克隆。對其進行生物學特性檢測表明，2s-piPSCs克隆呈堿性磷酸酶陽性;表達Na(i)ve狀態(tài)多能干細胞的候選多能性相關(guān)基因Oct4、Sox2、Klf4、Klf5、Rex1和SSEA1等，不表達Primed狀態(tài)多能干細胞的候選基因FGF5;QR

10、T-PCR結(jié)果表明該培養(yǎng)體系下的Klf4表達水平顯著高于2i+Lif+bFGF和bFGF組的克隆;此外，2s-piPSCs可以使用胰蛋白酶進行消化傳代，類似于小鼠胚胎干細胞的傳代培養(yǎng)，可形成單克隆。以上結(jié)果表明，p38和JNK通路抑制劑SB203580和SP600125可以促進piPSCs向Na(i)ve狀態(tài)轉(zhuǎn)變，獲得的2s-piPSCs克隆具有部分Na(i)ve狀態(tài)多能干細胞的生物學特性。
　　以上結(jié)果表明，PBMSCs重編程為