載bFGF基因靶向聲學(xué)微泡制備及其預(yù)防跟腱損傷術(shù)后粘連的研究.pdf

1、第一部分載bFGF基因靶向生物素化陽(yáng)離子聲學(xué)微泡的制備及其性質(zhì)檢測(cè)
　　目的：制備載bFGF基因的靶向聲學(xué)微泡，研究所制備微泡的基本性質(zhì)及其載基因能力，并進(jìn)行體外大鼠肝臟顯影實(shí)驗(yàn)。
　　方法：利用磷脂混懸液分別制備生物素化微泡、陽(yáng)離子微泡、生物素化陽(yáng)離子微泡，通過(guò)對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行聲學(xué)造影，比較分析不同種類微泡的顯影效果，通過(guò)“生物素-親和素”橋接法制備靶向生物素化陽(yáng)離子微泡MBICAM-1，用熒光免疫染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)微泡和

2、抗ICAM-1單抗的結(jié)合情況，制備載bFGF基因的生物素化陽(yáng)離子微泡，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)生物化陽(yáng)離子微泡載bFGF基因能力。光學(xué)顯微鏡下觀察上述所制備微泡的形態(tài)及分布，用分?jǐn)?shù)顆粒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)微泡的平均粒徑、濃度。
　　結(jié)果：利用磷脂懸浮液制備的三種微泡粒徑及濃度：生物素化陽(yáng)離子微泡：平均粒徑：0.89um，濃度：2.6×109/ml；靶向生物素化陽(yáng)離子微泡：平均粒徑：0.96um，濃度：1.9×109/ml；載bFGF基因生物

3、素化陽(yáng)離子微泡：平均粒徑：1.08um，濃度：1.1×108/ml。光學(xué)顯微鏡下可見三種微泡形態(tài)尚規(guī)則，分布尚均勻；在熒光顯微鏡下可見熒光劑標(biāo)記的靶向聲學(xué)微泡MBICAM-1表面可表達(dá)綠色熒光；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)微泡和抗ICAM-1單抗的結(jié)合率為93.3％；大鼠肝臟造影中三種微泡均表現(xiàn)為高增強(qiáng)，效果近似于臨床常用聲諾維微泡，其中制備的生物素化陽(yáng)離子微泡顯影效果強(qiáng)于陽(yáng)離子微泡和生物素化微泡；通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因與生物素化陽(yáng)離子

4、微泡結(jié)果顯示：生物素化陽(yáng)離子微泡的基因結(jié)合率最高可達(dá)37.3%。
　　結(jié)論：使用磷脂混懸液制備的微泡達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)聲學(xué)微泡規(guī)格，所制備的微泡在大鼠肝臟造影效果好，類似臨床使用聲諾維微泡，其中生物素化陽(yáng)離子微泡顯影效果最好，利用“生物素-親和素”橋接法制備的靶向聲學(xué)微泡MBICAM-1抗體結(jié)合率高，生物素化陽(yáng)離子微泡攜帶基因的效率高，可作為一種理想的基因載體。
　　第二部分載bFGF基因靶向聲學(xué)微泡預(yù)防跟腱損傷術(shù)后粘連
　　目

5、的：研究靶向聲學(xué)微泡MBICAM-1在體內(nèi)及體外的靶向能力以及超聲輻照介導(dǎo)載bFGF基因靶向聲學(xué)微泡預(yù)防家兔跟腱損傷術(shù)后粘連的可能性。
　　方法：體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)適量TNF液刺激，使臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞膜表達(dá)ICAM-1表面抗原，熒光顯微鏡下觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜ICAM-1表面抗原表達(dá)情況，在顯微鏡下觀察經(jīng)TNF刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與與靶向生物素化陽(yáng)離子微泡的體外結(jié)合情況。選取12只家兔，切斷一側(cè)跟腱腓腸肌支建立肌腱損

6、傷模型，給予跟腱斷端間斷縫合，制造跟腱損傷術(shù)后炎癥模型，將12只家兔分為4組：1組：?jiǎn)渭兡Ｐ徒M，2組：?jiǎn)渭兓蚪M，3組：超聲+載bFGF基因靶向生物素化陽(yáng)離子微泡；4組：超聲+載bFGF基因非靶向生物素化陽(yáng)離子微泡。經(jīng)耳緣靜脈注入，跟腱局部給予超聲輻照，輻照條件為(Mylab90,LA523探頭,頻率：7-10MHZ，MI：0.8，ankle模式輻照10s，間隔10s，共20min)，觀察造影處理下，靶向聲學(xué)微泡與非靶向微泡組跟腱造影情

7、況，每天觀察家兔雙側(cè)跟腱表面有無(wú)紅腫以及行走步態(tài)；7天后，再次給予相同處理，14天后處死各組家兔，觀察家兔跟腱周圍組織的粘連情況，取跟腱標(biāo)本進(jìn)行H-E染色，觀察跟腱恢復(fù)及粘連情況，利用免疫組織化學(xué)法觀察跟腱ICAM-1表達(dá)情況。
　　結(jié)果：熒光顯微鏡下觀察可見：經(jīng)TNF刺激后的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核表達(dá)藍(lán)色熒光，細(xì)胞膜表面表達(dá)綠色熒光；未經(jīng)TNF刺激的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核表達(dá)藍(lán)色熒光，細(xì)胞膜表面不表達(dá)綠色熒光，說(shuō)明經(jīng)TNF刺激可成功

8、使臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)ICAM-1膜表面抗原。體外靶向?qū)嶒?yàn)結(jié)果：經(jīng)TNF刺激的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附有帶綠色熒光的靶向聲學(xué)微泡MBICAM-1；未經(jīng)TNF刺激的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附的靶向聲學(xué)微泡MBICAM-1數(shù)量較少，大多數(shù)靶向聲學(xué)微泡MBICAM-1分散漂浮在細(xì)胞間。造模后家兔跟腱肉眼情況觀察：1組家兔（單純模型組）活動(dòng)明顯跛行，手術(shù)切口處可見縫線，周圍組織腫脹，傷口有少許滲出，跟腱與周圍組織都有中-重度粘連，可稍微和周圍組織分

9、離，跟腱斷端可見少許間隙，周圍組織充血腫脹；2組家兔（單純基因組）中度跛行，傷口基本愈合，但可見明顯疤痕，3只家兔跟腱與周圍組織都有重度粘連，完全不能與周圍組織分離，疤痕組織較多；3組家兔（超聲+載bFGF基因靶向生物素化陽(yáng)離子微泡）未見跛行，活動(dòng)正常，周圍組織輕度水腫，傷口愈合良好，3只家兔跟腱光鮮，有輕度腫脹，質(zhì)地韌，彈性良好；4組家兔（超聲+載bFGF基因非靶向生物素化陽(yáng)離子微泡）輕度跛行，周圍組織輕度水腫，傷口基本愈合，可見細(xì)小

10、疤痕，3只家兔跟腱光澤，有輕度腫脹，質(zhì)地較韌，彈性一般。造影模式（CEUS）下，造模后家兔跟腱觀察結(jié)果：非靶向生物素化陽(yáng)離子微泡組：左側(cè)跟腱呈微弱增強(qiáng)；右側(cè)跟腱呈微弱增強(qiáng)。靶向生物素化陽(yáng)離子微泡組：左側(cè)跟腱呈明顯增強(qiáng)。右側(cè)跟腱呈微弱增強(qiáng)。家兔跟腱蘇木素-伊紅（H-E）染色觀察發(fā)現(xiàn)：1組家兔（單純模型組）肌腱處膠原纖維排列紊亂、疏松，肌腱腱內(nèi)細(xì)胞成分與腱周細(xì)胞成分無(wú)明顯差異，并可見腱周疏松結(jié)締組織長(zhǎng)入肌腱腱鞘內(nèi)，腱鞘內(nèi)外分界不清。2組家兔

11、（單純基因組）肌腱腱內(nèi)細(xì)胞成分較1組肌腱腱內(nèi)多，但是少于腱外細(xì)胞成分，且腱鞘外膠原纖維排列紊亂致密，不同簇纖維束相互粘連在一起，且長(zhǎng)入肌腱斷端腱鞘內(nèi)，腱鞘內(nèi)外分界不清。3組家兔（超聲+載bFGF基因靶向生物素化陽(yáng)離子微泡）肌腱處膠原纖維排列規(guī)則，肌腱腱內(nèi)細(xì)胞成分比腱周細(xì)胞成分多，無(wú)明顯腱外腱周疏松結(jié)締組織長(zhǎng)入肌腱腱鞘內(nèi)，腱鞘內(nèi)外分界清楚。4組家兔（超聲+載bFGF基因非靶向生物素化陽(yáng)離子微泡）肌腱處膠原纖維排列尚規(guī)則，肌腱腱內(nèi)細(xì)胞成分比

12、腱周細(xì)胞成分多，但較3組腱鞘內(nèi)細(xì)胞成分少，無(wú)明顯腱外腱周疏松結(jié)締組織長(zhǎng)入肌腱腱鞘內(nèi)，腱鞘內(nèi)外分界清楚。家兔跟腱免疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)：1組家兔（單純模型組）跟腱腱鞘內(nèi)ICAM-1表達(dá)量與腱鞘外ICAM-1表達(dá)量基本持平，2組家兔（單純基因組）跟腱腱鞘內(nèi)ICAM-1表達(dá)量明顯低于腱鞘外ICAM-1表達(dá)量，3組家兔（超聲+載bFGF基因靶向生物素化陽(yáng)離子微泡）跟腱腱鞘內(nèi)ICAM-1表達(dá)量明顯高于腱鞘外ICAM-1表達(dá)量，4組家兔（超聲+載bF

13、GF基因非靶向生物素化陽(yáng)離子微泡）跟腱腱鞘內(nèi)ICAM-1表達(dá)量高于ICAM-1表達(dá)量。
　　結(jié)論：可通過(guò)TNF成功促使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜表達(dá)ICAM-1膜抗原；可通過(guò)局部跟腱切開縫合建立跟腱損傷術(shù)后炎癥模型；采用“生物素-親和素”橋接法制備的靶向聲學(xué)微泡MBICAM-1在體內(nèi)外均具有靶向效果。可通過(guò)超聲輻照+靶向聲學(xué)微泡介導(dǎo)bFGF基因在家兔跟腱組織的表達(dá)，靶向聲學(xué)微泡能更有效促進(jìn)bFGF基因與跟腱腱鞘內(nèi)組織相結(jié)合，從而使跟腱