牽伸載荷對(duì)大鼠跟腱微損傷的修復(fù)作用及其對(duì)TSCs立早基因的影響.pdf

1、肌腱微損傷是運(yùn)動(dòng)員和普通勞動(dòng)者中廣泛存在的組織損傷，常發(fā)生于反復(fù)、過度拉伸肌腱之后，表現(xiàn)為肌腱局部疼痛、腫脹和運(yùn)動(dòng)功能受限，組織學(xué)表現(xiàn)為肌腱纖維紊亂、斷裂。肌腱微損傷不能有效修復(fù)被認(rèn)為是誘發(fā)肌腱退變、肌腱病的主要原因。有報(bào)道顯示肩袖腱病在普通人中發(fā)病率為2.4～20％，跟腱病在高水平運(yùn)動(dòng)員中發(fā)病率高達(dá)52％，這對(duì)人們的日常生活和運(yùn)動(dòng)員的競(jìng)技水平產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。因此，研究微損傷修復(fù)的影響因素，尋找促進(jìn)微損傷修復(fù)方法是目前仍有待解決的問題

2、。
　　肌腱作為肌肉與骨之間的力學(xué)傳導(dǎo)組織，牽伸載荷對(duì)肌腱生理功能的維持起到重要作用。有學(xué)者認(rèn)為，長(zhǎng)期過度牽拉肌腱，使肌腱的損傷無法有效修復(fù)是導(dǎo)致肌腱病的重要原因。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，通過離心性牽伸訓(xùn)練可以緩解甚至治愈肌腱病。由此可見，牽伸載荷如一柄雙刃劍，即可導(dǎo)致肌腱損傷，又能促進(jìn)肌腱修復(fù)。所以，研究牽伸載荷對(duì)肌腱的作用機(jī)制，發(fā)揮其有利作用，避免其不利影響，是促進(jìn)肌腱微損傷修復(fù)的可靠途徑。
　　目的:
　　1.探討不同

3、牽伸載荷條件對(duì)大鼠微損傷跟腱修復(fù)的影響，明確有利于肌腱修復(fù)的應(yīng)力強(qiáng)度，闡明理想牽伸載荷對(duì)TSCs生物學(xué)特性的影響。
　　2.闡明牽伸載荷早期對(duì)TSCs立早基因表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1.大鼠跟腱微損傷動(dòng)物模型的建立
　　將6只8周齡雄性SD大鼠麻醉后，右側(cè)跟腱注射膠原酶溶液作為實(shí)驗(yàn)組，左側(cè)跟腱注射PBS溶液作為對(duì)照組。注射1周后通過跟腱組織的大體表現(xiàn)、組織病理學(xué)表現(xiàn)和分化標(biāo)志基因表達(dá)對(duì)比，判斷造模是否成功。

4、
　　2.牽伸載荷對(duì)大鼠跟腱微損傷修復(fù)的影響
　　將72只SD大鼠經(jīng)過適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練后，跟腱注射Ⅰ型膠原酶溶液，制備跟腱微損傷大鼠模型。然后依據(jù)跑臺(tái)強(qiáng)度條件將大鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組（籠中飼養(yǎng)）、低強(qiáng)度組(13m/min，20min/day)、高強(qiáng)度組(17m/min，1h/day)。在跑臺(tái)開始時(shí)、跑臺(tái)1周、跑臺(tái)4周時(shí)分別觀察大鼠跟腱的大體變化、組織病理學(xué)變化、生物力學(xué)變化以及成肌腱分化標(biāo)志基因表達(dá)變化。觀察不同跑臺(tái)條件的牽

5、伸載荷強(qiáng)度對(duì)微損傷跟腱修復(fù)的影響，明確有利于跟腱修復(fù)的理想牽伸載荷強(qiáng)度和時(shí)間點(diǎn)。
　　然后利用該理想牽伸載荷強(qiáng)度和時(shí)間點(diǎn)，對(duì)9只8周齡SD雄性大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，并分別將提取的TSCs標(biāo)記位為:對(duì)照組（跟腱注射PBS溶液）、誘導(dǎo)組（跟腱注射Ⅰ型膠原酶溶液）、誘導(dǎo)+跑臺(tái)組（跟腱注射Ⅰ型膠原酶溶液+理想強(qiáng)度跑臺(tái)）。觀察干預(yù)對(duì)TSCs的生物學(xué)影響:結(jié)晶紫染色觀察集落數(shù)量;倒置相差顯微鏡觀察集落形態(tài);CCK8法觀察增殖能力;流式細(xì)胞學(xué)觀察細(xì)

6、胞凋亡和細(xì)胞表面標(biāo)志物;免疫熒光觀察干性標(biāo)志物;細(xì)胞學(xué)染色、RT-PCR觀察細(xì)胞分化能力變化。
　　3.體外牽伸載荷對(duì)大鼠跟腱來源TSCs立早基因表達(dá)的影響
　　沿用本課題組成熟的TSCs分離、培養(yǎng)、傳代技術(shù)，利用自制細(xì)胞單軸循環(huán)牽拉裝置在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行牽拉。分別用2％～12％的牽拉強(qiáng)度和不同牽拉時(shí)間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組，利用RT-PCR觀察細(xì)胞在牽拉早期c-fos基因、分化標(biāo)志基因表達(dá)的特點(diǎn)。
　　結(jié)果:
　　1.Ⅰ

7、型膠原酶溶液誘導(dǎo)的大鼠跟腱組織與對(duì)照組相比，大體觀察表現(xiàn)為腱旁組織增多，肌腱黯淡缺乏光澤。組織學(xué)表現(xiàn)為異形細(xì)胞增多、膠原纖維排列紊亂、纖維損傷等。組織成肌腱標(biāo)志基因(ColⅠ、TNMD)表達(dá)明顯減少(p＜0.05)，成骨分化標(biāo)志基因(Runx2)表達(dá)增多(p＜0.05)。
　　2.對(duì)肌腱微損傷模型大鼠經(jīng)過1周的不同強(qiáng)度跑臺(tái)負(fù)荷刺激后，各實(shí)驗(yàn)組大鼠的跟腱在大體觀察、組織病理學(xué)表現(xiàn)及生物力學(xué)表現(xiàn)等方面未觀察到明顯變化(p＞0.05)，

8、但低強(qiáng)度組跟腱的成肌腱分化標(biāo)志基因(ColⅠ、TNMD)相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組和高強(qiáng)度組均升高(p＜0.05)。經(jīng)過4周跑臺(tái)牽伸載荷刺激后，各實(shí)驗(yàn)組間出現(xiàn)明顯差異:大體觀察，低強(qiáng)度組腱旁增生組織較對(duì)照組和高強(qiáng)度組明顯減少;組織學(xué)觀察，低強(qiáng)度組組織學(xué)半定量評(píng)分顯著低于對(duì)照組和高強(qiáng)度組，而高強(qiáng)度組的組織學(xué)評(píng)分明顯高于對(duì)照組和低強(qiáng)度組(p＜0.05);生物力學(xué)測(cè)試，低強(qiáng)度組與對(duì)照組相比，最終應(yīng)力與抗拉強(qiáng)度均明顯升高(p＜0.05);低強(qiáng)度組的組織

9、成肌腱標(biāo)志基因ColⅠ較對(duì)照組和高強(qiáng)度組明顯升高(p＜0.05)，各組間TNMD基因相對(duì)表達(dá)量未見明顯差異(p＞0.05)。
　　3.誘導(dǎo)+跑臺(tái)組的TSCs細(xì)胞集落數(shù)較誘導(dǎo)組減少，集落中的細(xì)胞分部較誘導(dǎo)組更緊湊，CCK-8法檢測(cè)到24h和48h的誘導(dǎo)+跑臺(tái)組TSCs的OD值較誘導(dǎo)組增高(p＜0.05)。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)在各實(shí)驗(yàn)組間無明顯差異。
　　誘導(dǎo)+跑臺(tái)組TSCs的細(xì)胞干性標(biāo)記物Nanog較誘導(dǎo)組表達(dá)增多(p＜0.05)。誘

10、導(dǎo)+跑臺(tái)組TSCs的細(xì)胞標(biāo)志物中CD44、CD73比例較對(duì)照組和誘導(dǎo)組升高。
　　誘導(dǎo)+跑臺(tái)組TSCs的成骨分化標(biāo)志基因(Runx2、Dlx5)、成軟骨分化標(biāo)志基因(ColⅡ)相對(duì)表達(dá)量較誘導(dǎo)組明顯減少(p＜0.05);而誘導(dǎo)+跑臺(tái)組成肌腱分化標(biāo)志基因(ColⅠ、TNMD)、成脂分化標(biāo)志基因(ap2、PPARγ)相對(duì)表達(dá)量較誘導(dǎo)組明顯增多(p＜0.05)。
　　經(jīng)過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，誘導(dǎo)+跑臺(tái)組的TSCs成骨分化標(biāo)志基因(Ru

11、nx2、Dlx5)相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組和誘導(dǎo)組顯著升高(p＜0.05)，誘導(dǎo)組的Runx2相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低(p＜0.05);經(jīng)過成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)后，誘導(dǎo)+跑臺(tái)組TSCs的成脂肪分化標(biāo)志基因（ap2、PPARγ）相對(duì)表達(dá)量較誘導(dǎo)組明顯升高(p＜0.05)，其中PPARγ相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組亦顯著升高(p＜0.05)，誘導(dǎo)組TSCs的PPARγ相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(p＜0.05);經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，誘導(dǎo)+跑臺(tái)組TSCs成軟骨分

12、化標(biāo)志基因(ColⅡ、Sox9)的相對(duì)表達(dá)量較誘導(dǎo)組明顯降低(p＜0.05);而誘導(dǎo)組TSCs的ColⅡ、Sox9基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組、誘導(dǎo)+跑臺(tái)組均明顯上升(p＜0.05)
　　4.與對(duì)照組相比，TSCs在4％和8％牽拉強(qiáng)度下在單軸循環(huán)牽拉30min時(shí)c-fosmRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值(p＜0.05)。2％牽拉強(qiáng)度即可使TSCs的c-fos mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(p＜0.05)，6％、8％、12％牽拉強(qiáng)度可使其相對(duì)表達(dá)量進(jìn)

13、一步升高(p＜0.05)。時(shí)間方面，僅牽拉5min即可使c-fos相對(duì)表達(dá)量明顯升高(p＜0.05)。8％牽拉強(qiáng)度在120min時(shí)，ColⅠ、TNMD、Dlx5、Runx2等基因相對(duì)表達(dá)量均升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Ⅰ型膠原酶溶液注射入SD大鼠跟腱后能夠在大體和組織病理學(xué)表現(xiàn)上模擬肌腱微損傷表現(xiàn)，該模型是一種比較理想的動(dòng)物模型。
　　2.不同強(qiáng)度牽伸載荷在1周對(duì)微損傷修復(fù)的影響無差異。低強(qiáng)度(13m/

14、min，20min/day)跑臺(tái)牽伸載荷4周能夠促進(jìn)大鼠微損傷跟腱的修復(fù);高強(qiáng)度(17m/min，1h/day)跑臺(tái)牽伸載荷4周阻礙微損傷肌腱的修復(fù)。因此對(duì)大鼠微損傷跟腱的修復(fù)來說，13m/min，20min/day跑臺(tái)4周是較為理想的牽伸載荷條件。
　　3.理想牽伸載荷條件對(duì)大鼠跟腱的TSCs影響主要表現(xiàn)在增殖能力強(qiáng)、集落形態(tài)集中、細(xì)胞干性增強(qiáng)、CD44和CD73表達(dá)增多、細(xì)胞向成肌腱和成脂肪方向分化等方面，說明牽伸載荷對(duì)TSC