載基因陽離子納米泡的制備及其抑制AIPC移植瘤生長的研究.pdf

1、背景:
　　近年來基因治療已經成為惡性腫瘤治療研究中的熱點。已有研究通過將治療基因靶向地導入腫瘤細胞內來達到治療惡性腫瘤的目的,取得了一些進展。然而,目前困擾基因治療的主要瓶頸問題之一仍是缺乏安全、有效和穩(wěn)定的基因體內傳輸系統(tǒng),常用的基因傳輸載體主要由病毒類載體及非病毒類載體兩類組成。非病毒載體主要有脂質體、質粒等,其優(yōu)點為具有良好的安全性能,但是同時存在轉染效率低的缺點,嚴重影響了基因治療的效果。病毒類載體例如慢病毒及腺病毒,雖

2、然有較高的轉染效率,但是其具有一定的毒性和免疫原性等缺點,臨床應用一直受到限制。因此構建一種安全性能好、轉染效率高的新型基因載體對基因治療具有極其重要的意義。超聲輻照聯合微泡介導的基因轉染(ultrasound and microbubble-mediated gene transfection,UMGT)是近年來發(fā)展起來的一種新型轉染技術,其中超聲微泡作為攜載基因的載體,具有安全、便捷、穩(wěn)定、高效等特點,不過目前的研究顯示,超聲微泡在

3、攜載治療基因、避免體內吞噬、防止體內治療基因被降解以及自身粒徑等方面仍存在著諸多不足。
　　前列腺癌的有效治療一直是目前臨床治療的難點,特別是雄激素非依賴性前列腺癌(androgen independent prostate cancer,AIPC),我們在前期研究中應用多聚賴氨酸法制備了攜載ARsiRNA的納米泡,并在體外實驗中證實其能聯合超聲輻照,將ARsiRNA有效轉染至C4-2細胞(AIPC細胞),抑制AIPC細胞的生長。

4、但我們的研究同時發(fā)現,多聚賴氨酸法是將帶有負電荷的超聲微泡與帶有正電荷的多聚賴氨酸結合使微泡表面帶有正電荷,從而能與帶有負電荷的siRNA結合,實現在微泡上攜載基因的目的,此種方法屬于一種間接靜電吸附法,攜載siRNA的穩(wěn)定性較差,雖然在體外實驗中抑制AIPC細胞生長的效果較好,但是要在體內應用必須在前期研究的基礎上開發(fā)和制備一種納米泡,其表面直接攜帶正電荷,從而能夠高效、直接地與治療基因(DNA、siRNA和質粒)結合,解決超聲微泡攜

5、載治療基因穩(wěn)定性差的缺點,從而實現在體內聯合超聲輻照能夠抑制AIPC移植瘤生長的作用。
　　目的:
　　結合上述研究進展和我們前期研究結果,本研究擬制備一種新型的陽離子納米泡,研究其在體外和體內的超聲物理特性與超聲造影特點。探討該陽離子納米泡與不同治療基因(siRNA、質粒、抗體)的結合能力。同時針對難治性的 AIPC,制備出攜載ARsiRNA的納米泡,檢測ARsiRNA的攜載量,并以AIPC細胞及其移植瘤為研究對象,分別研

6、究攜載ARsiRNA的陽離子納米泡聯合超聲輻照對AIPC細胞和移植瘤生長的影響,進一步觀察超聲輻照后細胞及移植瘤細胞膜微觀結構的變化規(guī)律,為納米泡作為基因載體聯合超聲輻照治療腫瘤提供詳實的實驗依據和研究基礎。
　　方法:
　　1.將魚精蛋白與其他脂質成分按照一定比例混合,運用冷凍干燥及機械振動法制備新型陽離子納米泡,檢測制備的納米泡的粒徑、表面電荷、濃度及其穩(wěn)定性。與微米泡SonoVue相比較,運用Philips iu22超

7、聲診斷儀在體外和體內實驗中分別檢測納米泡的物理特性和超聲造影特點。
　　2.檢測陽離子納米泡的生物安全性,通過熒光顯微鏡觀察陽離子納米泡攜載siRNA、質粒、抗體的能力,同時通過分光標度儀檢測陽離子納米泡的載ARsiRNA量,在體外實驗中轉染AIPC細胞(C4-2),并與脂質體相比較,運用CCK-8檢測兩種不同轉染方法抑制C4-2細胞生長的能力。
　　3.通過不同分組檢測載ARsiRNA的納米泡聯合超聲輻照抑制裸鼠AIPC移

8、植瘤生長的能力,通過qRT-PCR及WB檢測處理后移植瘤ARmRNA及AR蛋白的表達水平,同時通過掃描電鏡觀察超聲輻照后AIPC細胞及其移植瘤細胞膜表面的變化。
　　結果:
　　1.本實驗制備的陽離子納米泡形態(tài)規(guī)則、分布均勻、無明顯聚集,平均粒徑(521.2±37.57)nm,平均濃度為(1.2±0.37)x108/ml,表面Zeta電位(18.5±5.13)mv,陽離子納米泡的粒徑和表面電荷在制備一周內保持穩(wěn)定。陽離子納米

9、泡在體內外實驗中都有明顯的造影效果,與SonoVue相比,其在開始顯影時間、峰值強度等造影參數方面沒有明顯差別,在移植瘤以及裸鼠肝腎的超聲造影持續(xù)時間明顯長于后者。陽離子納米泡在裸鼠肝臟、腎臟和前列腺癌移植瘤中增強顯影的持續(xù)時間約20min,且在移植瘤顯影中陽離子納米泡的分布更為廣泛,能夠在微米級微泡不能顯影的腫瘤中心區(qū)域顯影。
　　2.熒光顯微鏡下發(fā)現魚精蛋白陽離子納米泡可以有效攜載siRNA、質粒、抗體,并能有效轉染腫瘤細胞、

10、原代細胞及干細胞。其中,載Cy3ARsiRNA的陽離子納米泡在鏡下發(fā)出紅色的熒光,部分呈“指環(huán)狀”;其最大基因攜載量約為(15-16)μg/108個納米泡;載ARsiRNA的陽離子納米泡聯合超聲輻照可以有效轉染C4-2細胞,CCK-8生長曲線顯示,與傳統(tǒng)的脂質體轉染方法相比,前者的細胞生長抑制率明顯高于脂質體(P<0.05)。
　　3.載ARsiRNA的陽離子納米泡聯合超聲輻照可以抑制裸鼠AIPC移植瘤的生長,移植瘤的 AR蛋白及

11、 ARmRNA的表達水平明顯降低,同時接受治療后的移植瘤冰凍切片熒光顯微鏡結果顯示,Cy3ARsiRNA可以穿透血管進入移植瘤組織;掃描電鏡發(fā)現無論是體外細胞還是移植瘤實體細胞,其細胞膜表面均有孔道形成。
　　結論:
　　1.魚精蛋白陽離子納米泡大小一致、分布均勻,表面帶有正電荷,穩(wěn)定性能好,具有良好的體外和體內超聲造影效果。
　　2.魚精蛋白陽離子納米泡可以有效攜載不同的治療基因(siRNA、質粒、抗體),體外實驗中

12、聯合超聲輻照可以有效轉染多種不同細胞,針對AIPC細胞,載ARsiRNA的陽離子納米泡聯合超聲輻照能有效抑制AIPC細胞的生長。
　　3.載ARsiRNA陽離子納米泡聯合超聲輻照可以使AIPC移植瘤的AR蛋白質及ARmRNA的表達受到抑制,從而達到有效抑制AIPC移植瘤生長的效果。超微形態(tài)學觀察證實,載ARsiRNA陽離子納米泡聯合超聲輻照處理后,AIPC細胞及其移植瘤細胞膜上有明顯的孔道形成,表明載 ARsiRNA的陽離子納米泡