MiR-3665、miR-375和miR-4530在食管鱗狀細(xì)胞癌中甲基化及其與預(yù)后的研究.pdf

1、目的：
　　通過檢測(cè)食管鱗癌患者癌組織與癌旁組織中 hsa-miR-3665、hsa-miR-375和hsa-miR-4530基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，來(lái)探討 hsa-miR-3665、hsa-miR-375和hsa-miR-4530分別與食管鱗癌患者的臨床資料及預(yù)后的關(guān)系，找出影響食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)的microRNA，為食管鱗癌預(yù)后判斷提供依據(jù)。
　　方法：
　　1、收集145例2012年07月至2014年

2、07月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、漳州市第一醫(yī)院和安溪縣醫(yī)院就診的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的新鮮癌組織與癌旁組織（距離癌組織＞3cm），以及相應(yīng)的臨床資料和隨訪資料,隨訪時(shí)間至2015年05月09日止。
　　2、設(shè)計(jì) hsa-miR-3665、hsa-miR-375和hsa-miR-4530基因甲基化引物，采用甲基化敏感性高分辨率溶解曲線檢測(cè)上述食管鱗癌患者的癌組織與癌旁組織的甲基化水平。結(jié)合上述臨床資料和隨訪資料，找出與食管鱗癌患者臨床

3、參數(shù)及預(yù)后有關(guān)的microRNA。
　　3、MTT法測(cè)定濃度為5μM、10μM、20μM、50μM和100μM的EGCG作用后Eca109細(xì)胞生長(zhǎng)情況，運(yùn)用析因分析其與濃度、時(shí)間關(guān)系；以濃度為20μM的EGCG作用食管癌Eca109細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定篩出的microRNA表達(dá)量，檢測(cè)20μM EGCG與甲基化抑制劑1μM DAC兩者的甲基化水平。
　　結(jié)果：
　　1、設(shè)計(jì)出四對(duì)相應(yīng)的甲基化引物，其中 hsa

4、-miR-3665(2)中甲基化水平高的癌組織相應(yīng)的癌旁組織甲基化水平也高，關(guān)聯(lián)性分析得出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.800，P=0.022）。
　　2、與臨床資料的比較，臨床參數(shù)中 TNM分期與 hsa-miR-3665(2)甲基化水平有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.024)，大多患者處于TNM分期II期和III期且甲基化水平處于50％～100%之間；殘端受侵、TNM分期、術(shù)后感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與 hsa-miR-375甲基化水

5、平有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.024，P=0.016，P<0.001和P=0.017)，無(wú)殘端受侵、無(wú)術(shù)后感染、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比有殘端受侵、有術(shù)后感染、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者多且甲基化水平高，TNM分期情況同 hsa-miR-3665(2)；而食管鱗癌患者浸潤(rùn)程度、殘端受侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與 hsa-miR-4530甲基化水平有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026，P=0.038和P=0.015)，大多患者處于浸潤(rùn)程度T3且甲基化水平處于0%～

6、50%，殘端受侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲基化情況與hsa-miR-375相同。
　　3、hsa-miR-3665(2)和hsa-miR-375中各甲基化水平組間two-stage檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TSPV=0.014，TSPV<0.001）。進(jìn)行 COX多因素回歸模型分析結(jié)果顯示：miR-4530甲基化水平與預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.040）。
　　4、EGCG在不同作用時(shí)間和不同作用濃度下，對(duì)食管癌細(xì)胞抑制情況不同。

7、實(shí)時(shí)定量RT-PCR顯示作用48 h和72 h后，EGCG和DAC的hsa-miR-3665(2)表達(dá)上調(diào)，甲基化水平的檢測(cè)結(jié)果也顯示與對(duì)照相比兩者在48 h和72 h時(shí)甲基化水平均降低。
　　結(jié)論：
　　1、hsa-miR-3665在食管鱗癌癌組織與癌旁組織的甲基化水平存在關(guān)聯(lián)性，且甲基化水平高的癌組織相應(yīng)的癌旁組織甲基化水平也高。
　　2、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌hsa-miR-375和hsa-miR-4530甲

8、基化水平比有轉(zhuǎn)移的高。hsa-miR-3665(2)和hsa-miR-375與TNM分期有關(guān)，大多患者在TNM分期II期和III期且甲基化水平處于50%～100%。hsa-miR-4530甲基化水平與浸潤(rùn)程度有關(guān)，大多患者在浸潤(rùn)程度T3且甲基化水平處于0%～50%。無(wú)殘端受侵的食管鱗癌hsa-miR-375和hsa-miR-4530比有殘端受侵患者多且甲基化水平高，無(wú)術(shù)后感染的食管鱗癌hsa-miR-375比有術(shù)后感染患者多且甲基化水平