腫瘤FOXP3促胰腺導(dǎo)管腺癌招募Treg及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　FOXP3是主要表達(dá)于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子[1]。它的主要功能是促進(jìn)T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，促進(jìn)機(jī)體的免疫抑制功能[2]。然而，近期多項(xiàng)研究顯示，除外T細(xì)胞，F(xiàn)OXP3也被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞與黑色素瘤細(xì)胞等等[3-5]。研究腫瘤源性 FOXP3（cancer-FOXP3, c-FOXP3）的功能，可能為胰腺導(dǎo)管腺癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)閱讀

2、中發(fā)現(xiàn)，相較于正常組織和細(xì)胞系，胰腺導(dǎo)管腺癌組織及細(xì)胞系高表達(dá)c-FOXP3[6]。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了該課題以進(jìn)一步明確c-FOXP3在胰腺導(dǎo)管腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平、功能效應(yīng)、以及背后的調(diào)控機(jī)制；旨從臨床患者水平、細(xì)胞功能水平、分子生物學(xué)水平及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平深入探索胰腺導(dǎo)管腺癌中c-FOXP3的功能與意義。
　　方法：
　　1.應(yīng)用胰腺導(dǎo)管腺癌組織的石蠟標(biāo)本切片進(jìn)行FOXP3的免疫組化染色,分析c-FOXP3蛋白在胰腺導(dǎo)管

3、腺癌組織中的表達(dá)水平；同時(shí)收集整理患者的臨床病例資料并行預(yù)后隨訪，分析胰腺導(dǎo)管腺癌中c-FOXP3的表達(dá)水平與各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。
　　2.分析胰腺導(dǎo)管腺癌組織標(biāo)本中c-FOXP3表達(dá)水平與Treg細(xì)胞在腫瘤局部富集程度的相關(guān)性；并分析c-FOXP3表達(dá)于Treg細(xì)胞聚集對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌患者臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的共同影響。
　　3.應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)4個(gè)胰腺癌細(xì)胞系及正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞系的c-FOXP

4、3的表達(dá)水平，并構(gòu)建c-FOXP3過表達(dá)與降表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；用Western blot驗(yàn)證構(gòu)建的穩(wěn)系所表達(dá)c-FOXP3的水平。通過細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、Edu增殖摻入實(shí)驗(yàn)與免疫缺陷動(dòng)物模型等多種方法檢測(cè) c-FOXP3對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用；通過免疫正常的動(dòng)物模型檢測(cè)c-FOXP3對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的作用。
　　4.分離人源外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Mononuclear Cells, PBMCs)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(R

5、egulatory T Cells, Treg cells)。利用共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)c-FOXP3對(duì)Treg細(xì)胞的促增殖作用；利用Transwell系統(tǒng)在體外模擬Treg細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的募集過程，檢測(cè)Treg細(xì)胞的趨化水平。構(gòu)建裸鼠胰腺癌原位成瘤模型，同時(shí)由鼠尾靜脈注射人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，體內(nèi)驗(yàn)證c-FOXP3促Treg細(xì)胞向胰腺癌微環(huán)境的趨化作用，
　　5.應(yīng)用RT-PCR的方法篩選c-FOXP3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞所分泌的

6、趨化因子譜；應(yīng)用Western blot、ELISA及免疫組化染色等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RT-PCR結(jié)果；應(yīng)用CHIP及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-FOXP3調(diào)控趨化因子表達(dá)分泌的分子機(jī)制。
　　6.通過趨化因子阻斷試驗(yàn)確定c-FOXP3促進(jìn)Treg細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境趨化過程的中介因子。構(gòu)建C57/BL黑鼠皮下成瘤動(dòng)物模型，通過阻斷趨化因子進(jìn)一步確定c-FOXP3引起Treg細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境募集的通路及該通路的生物學(xué)功能，確定胰腺導(dǎo)管腺癌靶向治療目標(biāo)

7、，從而實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)果：
　　1. c-FOXP3表達(dá)及Treg細(xì)胞聚集在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的意義。通過對(duì)120例胰腺導(dǎo)管腺癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，c-FOXP3在胰腺導(dǎo)管腺癌中多數(shù)表達(dá)陽(yáng)性，而對(duì)應(yīng)的癌旁正常胰腺組織不表達(dá)或表達(dá)程度極弱；分析該120例患者的病例資料，我們發(fā)現(xiàn) c-FOXP3高表達(dá)的占63.3％（76例）， c-FOXP3低表達(dá)的占36.6%（44例）；進(jìn)一步研究 c-FOXP3蛋白表達(dá)水

8、平與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)c-FOXP3的胰腺導(dǎo)管腺癌患者的總生存期（中位數(shù)：24 vs15個(gè)月）與無(wú)復(fù)發(fā)生存期（中位數(shù)：15 vs9個(gè)月）均明顯低于短于c-FOXP3低表達(dá)組的患者（p<0.05*）。
　　同時(shí)，F(xiàn)OXP3陽(yáng)性的Treg細(xì)胞在胰腺癌組織中也有不同程度的表達(dá)。我們深入研究了胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞中c-FOXP3的表達(dá)與FOXP3陽(yáng)性Treg細(xì)胞在腫瘤局部微環(huán)境中聚集程度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者呈明顯的正相關(guān)

9、(r=0.537， p<0.001**)。統(tǒng)計(jì)分析后我們發(fā)現(xiàn)，c-FOXP3高表達(dá)同時(shí)伴隨 Treg細(xì)胞在腫瘤中高度聚集的患者的總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期明顯短于c-FOXP3高表達(dá)Treg低浸潤(rùn)的患者，同時(shí)，c-FOXP3高表達(dá)同時(shí)Treg細(xì)胞高度浸潤(rùn)的患者的腫瘤大小也明顯大于c-FOXP3高表達(dá)Treg低浸潤(rùn)的患者；這些結(jié)果提示，Treg細(xì)胞浸潤(rùn)程度在c-FOXP3高表達(dá)對(duì)患者生存期的影響中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能，引起胰腺導(dǎo)管腺癌的進(jìn)展

10、。
　　2. c-FOXP3對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系的直接與間接影響。利用 Western blot驗(yàn)證了c-FOXP3在4個(gè)胰腺癌細(xì)胞系（PANC-1、MIA PaCa-2、AsPC-1及BxPC-3）均有不同程度的表達(dá)，而在正常胰腺細(xì)胞系HPDE6C7中表達(dá)極弱；并且成功構(gòu)建了2個(gè)過表達(dá) c-FOXP3的胰腺癌細(xì)胞系(PANC-1及 AsPC-1)和2個(gè)降表達(dá)c-FOXP3的細(xì)胞系(MIA PaCa-2和BxPC-3)，構(gòu)建的穩(wěn)系

11、經(jīng)Western blot驗(yàn)證了c-FOXP3表達(dá)的變化。通過細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、Edu增殖摻入與免疫缺陷動(dòng)物模型證明c-FOXP3對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯的直接影響。
　　3.免疫系統(tǒng)完整的小鼠體內(nèi)皮下成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)，降表達(dá)c-FOXP3的胰腺癌細(xì)胞成瘤大小明顯小于其對(duì)照組細(xì)胞成瘤，并且其瘤塊中Treg浸潤(rùn)也明顯少于對(duì)照組；同時(shí)，CD25抗體特異清除免疫系統(tǒng)完整小鼠 Treg細(xì)胞后，降表達(dá)c-FOXP3的胰腺癌細(xì)胞成瘤與對(duì)照組成瘤大小無(wú)統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)差別，證明了Treg細(xì)胞參與c-FOXP3對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的間接影響。
　　4.利用體外共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞與Treg細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過Edu增殖摻入檢測(cè)發(fā)現(xiàn)c-FOXP3不能促進(jìn)Treg細(xì)胞自身增殖。利用體外Transwell趨化實(shí)驗(yàn)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞過表達(dá)c-FOXP3后對(duì)Treg細(xì)胞的趨化能力增強(qiáng)；而降表達(dá)c-FOXP3后對(duì)Treg的趨化能力下降。裸鼠原位成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)c-FOXP3的人源胰腺癌細(xì)

13、胞成瘤對(duì)經(jīng)由鼠尾注射的人外周血單個(gè)核細(xì)胞中Treg細(xì)胞的趨化能力明顯強(qiáng)于未過表達(dá)c-FOXP3的對(duì)照組成瘤。
　　5.實(shí)時(shí)定量PCR篩選出趨化因子CCL5表達(dá)水平隨c-FOXP3表達(dá)變化而變化的程度最為顯著，Western blot證實(shí)，胰腺癌細(xì)胞內(nèi)CCL5表達(dá)水平受c-FOXP3的調(diào)控；ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胰腺癌細(xì)胞向外釋放CCL5的水平也受c-FOXP3調(diào)控；同時(shí)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，c-FOXP3與 CCL5的表達(dá)胰腺癌組織中呈

14、現(xiàn)共定位，并有明顯的正相關(guān)性(r=0.681, P<0.001**)。
　　5.利用Panc-1、Pan02和293T細(xì)胞系，我們行ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人源與鼠源轉(zhuǎn)錄因子FOXP3均可分別直接結(jié)合于相應(yīng)種屬CCL5的啟動(dòng)子區(qū)；同時(shí)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá) c-FOXP3后 CCL5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，而突變上述FOXP3與CCL5結(jié)合位點(diǎn)后，其轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)即被反轉(zhuǎn)，從而證實(shí)c-FOXP3可以直接調(diào)控CCL5的表達(dá)。
　　6.

15、體外Transwell趨化模型阻斷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)CCL5進(jìn)行中和阻斷可明顯減弱過表達(dá)c-FOXP3的胰腺癌細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞的趨化作用；體內(nèi)胰腺皮下成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CCL5阻斷不僅減弱了 Treg細(xì)胞向腫瘤局部的浸潤(rùn)，同時(shí)抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，并且該現(xiàn)象在高表達(dá)c-FOXP3的腫瘤中更為明顯。
　　結(jié)論：
　　1. c-FOXP3蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織及細(xì)胞系中呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)；c-FOXP3表達(dá)水平與Treg細(xì)胞聚集程度正相關(guān)；c

16、-FOXP3表達(dá)水平較高且Treg細(xì)胞比例高的患者預(yù)后較差。
　　2. c-FOXP3直接結(jié)合至CCL5的啟動(dòng)子區(qū)，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄翻譯過程，上調(diào)CCL5在胞內(nèi)的表達(dá)及其向胞外的分泌。
　　3.以CCL5為介導(dǎo)，c-FOXP3促進(jìn)了胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞的趨化能力。高表達(dá)的c-FOXP3與Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的高度浸潤(rùn)共同作用，促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤的生長(zhǎng)。
　　4.對(duì)高表達(dá)c-FOXP3的胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤進(jìn)行