MiR-99a在胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)及調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究.pdf

1、前言：
　　胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率和病死率幾乎持平，西方國(guó)家多發(fā)，在美國(guó)胰腺癌死亡率長(zhǎng)期居于惡性腫瘤死因的第四位，在我國(guó)胰腺癌患者的數(shù)量也呈逐年遞增趨勢(shì)，據(jù)流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)的胰腺癌發(fā)病率已達(dá)5.1/10萬，病死率居腫瘤死亡率的第六位。胰腺癌早期多無特異性癥狀，約80％的患者確診時(shí)已經(jīng)是腫瘤晚期，5年生存率小于5％，中位生存期僅為6個(gè)月。手術(shù)切除是目前治療胰腺癌最有效的方法，但僅有約20％的患者符合手

2、術(shù)指征，即使手術(shù)患者因?yàn)樵缙趶?fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移術(shù)后的5年生存率也低于20％。大部分病人因?yàn)榇_診時(shí)已經(jīng)存在局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而預(yù)后更差。化療藥物的應(yīng)用對(duì)于非手術(shù)患者的治療提供了一線希望，但由于早期出現(xiàn)的高度耐藥，治療效果也不甚理想。因此，對(duì)于胰腺癌發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)行為的研究具有重要的臨床指導(dǎo)意義及實(shí)用價(jià)值。
　　microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸(nt)的非編碼小RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。其作用機(jī)

3、制是miRNA與其靶mRNA的3'UTR區(qū)互補(bǔ)，當(dāng)部分配對(duì)時(shí)阻抑靶mRNA的翻譯，與靶基因3'UTR區(qū)域完全配對(duì)時(shí)，使靶mRNA降解。經(jīng)預(yù)測(cè)microRNA可能控制哺乳類動(dòng)物30％的蛋白編碼基因的活性，與其靶mRNA分子組成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與包括細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞分化、發(fā)育和逆境應(yīng)答等多種生物學(xué)過程。有研究報(bào)道顯示，miRNA在多種腫瘤中表達(dá)有改變，可能與腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞凋亡和侵襲等有關(guān)，被認(rèn)為可能起癌基因或抑癌基因的作用。<

4、br>　　隨著miRNA在胰腺癌的研究越來越多也越來越深入。不僅通過microarry方法獲得胰腺癌的miRNA表達(dá)譜，了解胰腺癌中所表達(dá)的miRNA，而且了解了許多胰腺癌中差異較大的miRNA的表達(dá)量的變化:miR-21、miR-18a、miR-196a、 miR-10b、 miR-16、miR-155、miR-181a、miR-181b、 miR-200b、miR-200c、miR-210上調(diào);miR-34a、miR-101、let

5、-7a、b、miR-217、miR-146、miR-148下調(diào)。已有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為這些在胰腺癌中表達(dá)有差異的microRNA(miRNA)在胰腺癌的生物學(xué)行為中起重要作用，例如:增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及藥物抵抗等。microRNA(miRNA)在胰腺癌的功能研究涉及從生物學(xué)到疾病標(biāo)志的研究。因此，miRNA可以用于胰腺癌的診斷、預(yù)后、藥物及手術(shù)效果的評(píng)價(jià)。
　　miRNA-99a是miRNA-99家族成員，位于染色體21q21，有研

6、究表明miR-99a在諸多人類惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，如肝癌、頭頸鱗細(xì)胞癌、口腔鱗癌以及腎細(xì)胞癌、肺癌等。IGF-1R和mTOR是miR-99a的直接靶基因。提示miRNA-99a與人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)，Turcatel等人的研究表明miRNA-99a參與了TGF-β誘導(dǎo)的乳腺細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并可能與乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，Jung等人報(bào)道稱miRNA-99a在胰腺癌干細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，提示miRNA-99a可

7、能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展以及其惡性表型有關(guān)。但有關(guān)miRNA-99a機(jī)制的研究還比較少，而且在胰腺癌組織中的研究尚未見報(bào)道。
　　基于miR-99a的研究現(xiàn)狀及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，本課題的研究目的是檢測(cè)miR-99a在胰腺癌組織中的表達(dá)情況，然后通過改變miR-99a的表達(dá)水平觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并分析其可能作用的靶標(biāo)在胰腺癌中的改變，進(jìn)一步闡明miR-99a在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用，為深入理解胰腺癌

8、發(fā)病的分子機(jī)制及分子靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法與結(jié)果：
　　1、在人胰腺癌組織標(biāo)本中檢測(cè)miR-99a表達(dá)情況，對(duì)比癌與癌旁組織間的表達(dá)差異，并分析miR-99a與臨床病理特征間的相關(guān)性。
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用realtime PCR方法檢測(cè)42例人胰腺癌組織及癌旁組織中miR-99a表達(dá)量，結(jié)果顯示miR-99a在癌組織表達(dá)較癌旁組織下調(diào)。分析了胰腺癌組織中miR-99a表達(dá)水平與患者年齡、性別、分化程度、臨床分期、

9、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果顯示，胰腺癌組織中miR-99a的表達(dá)量與患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P＜0.01)，而與患者的性別、年齡和腫瘤分化程度無關(guān)。miR-99a低表達(dá)組平均生存期為11個(gè)月，而miR-99a高表達(dá)組平均生存期為17個(gè)月，并經(jīng)LogRank檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、在人胰腺癌組織標(biāo)本中應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)mTOR、EMT關(guān)鍵分子E-cadherin的表達(dá)，并分析與miR-99a

10、表達(dá)的相關(guān)性。
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，評(píng)估42例人胰腺癌組織中mTOR、E-cadherin的表達(dá)水平。mTOR在正常胰腺組織中呈陰性，而在癌組織中57.14％(24/42)病例為高表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析胰腺癌組織mTOR表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。E-cadherin在正常胰腺組織中均高表達(dá)，而在癌組織中38.09％病例低表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明胰腺癌E-cadherin表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。并且在胰腺癌組織mTOR與E

11、-cadherin具有相關(guān)性，呈負(fù)相關(guān);miR-99a與mTOR具有相關(guān)性，呈負(fù)相關(guān)。
　　3、miRNA-99a的阻斷劑轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，檢測(cè)抑制miRNA-99a后對(duì)胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并進(jìn)一步研究miRNA-99a影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的靶基因。
　　胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC-1轉(zhuǎn)染miR-99a阻斷劑后， miR-99a表達(dá)進(jìn)一步降低。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-99a表達(dá)降低促進(jìn)ASPC-1增殖。細(xì)胞劃痕實(shí)

12、驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-99a表達(dá)降低促進(jìn)ASPC-1遷移、侵襲。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-99a表達(dá)降低促進(jìn)mTOR及EMT相關(guān)蛋白N-cadherin，SMA，Vimentin的表達(dá);抑制E-cadherin的表達(dá)。ASPC-1轉(zhuǎn)染mTOR siRNA后， mTOR表達(dá)降低，同時(shí)E-cadherin表達(dá)增強(qiáng);進(jìn)一步轉(zhuǎn)染miR-99a拮抗劑后可恢復(fù)mTOR的抑制，并降低E-cadherin的表達(dá)。

13、r>　　結(jié)論：
　　1、人胰腺癌組織中miR-99a表達(dá)低于癌旁組織， miR-99a低表達(dá)促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并增加臨床分期。人胰腺癌組織中miR-99a低表達(dá)提示預(yù)后不良。
　　2、miR-99a低表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　3、 miR-99a低表達(dá)下調(diào)EMT關(guān)鍵分子E-cadherin表達(dá)。
　　4、miR-99a表達(dá)抑制可通過調(diào)節(jié)mtor蛋白而下調(diào)E-cadherin表達(dá)、促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移