腫瘤相關(guān)炎癥細(xì)胞的促腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、炎癥，是腫瘤的十大特征之一。炎性微環(huán)境對(duì)腫瘤的影響成為新的研究熱點(diǎn)。微環(huán)境中浸潤(rùn)的白細(xì)胞包括肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(TAN)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)等多種細(xì)胞亞型，他們是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分，并發(fā)揮了腫瘤促進(jìn)或抑制的重要作用。
　　1.肺腺癌、咯血與炎癥
　　肺癌在世界范圍內(nèi)居于癌癥相關(guān)死亡原因首位。肺癌患者最常見(jiàn)的癥狀包括咳嗽、呼吸困難、咯血等。盡管咯血是肺癌最常見(jiàn)的臨床

2、表現(xiàn)之一，但是治療前咯血的發(fā)生情況尚無(wú)確切數(shù)據(jù)，且咯血的機(jī)制也尚未明確，尤其是對(duì)于輕到中度咯血?？赡艿臋C(jī)制涉及新血管生成、血管侵犯、腫瘤壞死、侵襲過(guò)程或咳嗽引起的損傷等，我們通過(guò)回顧性分析，發(fā)現(xiàn)咯血是肺腺癌根治術(shù)后的獨(dú)立預(yù)后因素，腫瘤血管侵犯是咯血的重要原因，且咯血肺腺癌患者外周血中白細(xì)胞水平明顯增高。為了進(jìn)一步明確炎癥、白細(xì)胞和腫瘤侵襲能力之間的相關(guān)性，我們進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　2.腫瘤相關(guān)炎癥
　　慢性炎癥是腫瘤微環(huán)

3、境中的一個(gè)固有的特點(diǎn)。腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)包括局部炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是浸潤(rùn)到腫瘤組織中的重要的免疫細(xì)胞。他們參與集體的防御機(jī)制，在損傷或感染的情況下發(fā)揮重要的作用。在腫瘤局部炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。在腫瘤微環(huán)境的影響下，巨噬細(xì)胞可以表現(xiàn)出經(jīng)典的激活狀態(tài)（M1型）和選擇性激活狀態(tài)(M2)型并分別發(fā)揮抗腫瘤和促腫瘤的功能，在炎癥和腫瘤的相互作用中發(fā)揮著重要的作用，目前相關(guān)研究已經(jīng)較深入。與之相比，中性粒細(xì)胞的相關(guān)

4、研究開(kāi)展較晚。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，與巨噬細(xì)胞類似，中性粒細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的調(diào)控下也能發(fā)揮抗腫瘤（N1型）或促腫瘤（N2型）的作用。其中TGF-β是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞發(fā)生功能轉(zhuǎn)換的重要調(diào)控因子。
　　由于巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞特殊的促腫瘤作用，且肺腺癌咯血患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高，我們對(duì)肺腺癌外周血白細(xì)胞亞型中單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞進(jìn)行了分析，并發(fā)現(xiàn)咯血患者中性粒細(xì)胞水平明顯增高，而單核細(xì)胞在咯血和非咯血患者中無(wú)明顯差異。
　　3.腫瘤

5、相關(guān)中性粒細(xì)胞(TAN)
　　循環(huán)中的中性粒細(xì)胞占白細(xì)胞的70％，在感染或者組織損傷時(shí)，它們被率先募集到病變部位，吞噬病原體，釋放不同的效應(yīng)分子。微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞能夠生成多種趨化因子，這些趨化因子被釋放進(jìn)入血液循環(huán)，與中性粒細(xì)胞表面高表達(dá)的CXCR1和CXCR2受體結(jié)合，通過(guò)趨化作用募集中性粒細(xì)胞遷移到腫瘤區(qū)域，進(jìn)而發(fā)揮至關(guān)重要的作用。然而臨床研究中的TAN的作用尚存在爭(zhēng)議，對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了綜述和meta分析，證實(shí)腫瘤內(nèi)

6、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在頭頸部腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌中是獨(dú)立預(yù)后因素，然而在胃癌中，卻無(wú)預(yù)后價(jià)值。對(duì)于TAN在食管癌中發(fā)揮的作用和機(jī)制尚不明確，在進(jìn)一步的研究中對(duì)TAN在食管鱗癌的以及咯血肺腺癌中的作用進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　4.TAN與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)
　　EMT是指有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞，是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程，也是上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞獲得惡性表型的關(guān)鍵機(jī)制。EMT過(guò)程受

7、TGF-β、Ras、Wnt等多條信號(hào)通路調(diào)節(jié)，其中TGF-β信號(hào)通路是誘導(dǎo)EMT的經(jīng)典通路之一。TGF-β通過(guò)Smad依賴性通路和多條Smad非依賴性通路共同參與EMT過(guò)程。
　　本課題將從咯血這一常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)人手，探討咯血的預(yù)后價(jià)值及相關(guān)機(jī)制。并對(duì)研究中發(fā)現(xiàn)的咯血患者外周血白細(xì)胞水平明顯升高這一現(xiàn)象進(jìn)行深入研究，在局部炎癥反應(yīng)水平上探討腫瘤相關(guān)炎癥細(xì)胞的促腫瘤作用及可能機(jī)制，力圖明確TAN在咯血肺腺癌和食管鱗癌中的作用和相關(guān)機(jī)

8、制。此外，在系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)水平上證實(shí)LMR在肺癌的重要預(yù)后價(jià)值。這將為闡明腫瘤相關(guān)炎癥細(xì)胞的促腫瘤作用提供更為有利的依據(jù)。
　　第一部分 咯血是根治術(shù)后肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素
　　目的：1.明確咯血在肺腺癌中的預(yù)后價(jià)值;
　　2.探討肺腺癌咯血的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：1.對(duì)根治術(shù)后肺腺癌患者進(jìn)行了回顧性研究，以總生存期(OS)、無(wú)病生存期(DFS)、疾病特異性生存期(DSS)做為觀察終點(diǎn)，分析了咯血的預(yù)后價(jià)值;

9、
　　2.探討引起咯血的可能機(jī)制:利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)腫瘤組織VEGF的表達(dá)、腫瘤壞死、血管侵犯以及微血管密度情況進(jìn)行評(píng)估分析;
　　3.分析咯血與臨床病理特征的相關(guān)性。
　　結(jié)果：1.咯血在根治術(shù)后肺腺癌患者中是不良OS，DSS及DFS(p值均＜0.001)的重要預(yù)測(cè)因素;
　　2.與非咯血組相比，咯血組腫瘤血管侵犯明顯，而VEGF表達(dá)、腫瘤壞死和腫瘤周圍微血管密度(MVD)兩組間無(wú)明顯差異;
　　結(jié)論

10、：1.咯血是根治術(shù)后肺腺癌患者的重要預(yù)后因素。
　　2.血管侵犯而不是血管生成或腫瘤壞死可能是肺腺癌患者咯血的最重要的機(jī)制。
　　第二部分 TAN促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞EMT
　　研究目的：1.明確咯血肺腺癌與外周血中白細(xì)胞亞型:中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的相關(guān)性;
　　2.在局部炎癥反應(yīng)水平探討腫瘤組織中TAN的作用。
　　方法：1.Mann-Whitney U檢驗(yàn)法比較咯血和非咯血組肺腺癌患者外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)

11、胞的分布差異;
　　2.利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺腺癌腫瘤組織中CD66b+ TAN及腫瘤組織E-cadherin的表達(dá)水平;
　　3.建立中性粒細(xì)胞和肺腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型，利用Western blot檢測(cè)腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況;
　　4.利用ELISA檢測(cè)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清中TGF-β1的變化，RT-PCR檢測(cè)TGF-β1的來(lái)源;
　　5.利用transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能

12、力的變化。
　　結(jié)果：1.肺腺癌咯血與外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)，與單核細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性;
　　2.咯血與腫瘤組織中TAN浸潤(rùn)有顯著的相關(guān)性，咯血組TAN浸潤(rùn)機(jī)率明顯高于非咯血組(0R=4.25，95％ CI1.246-14.502);
　　3.腫瘤組織中CD66+ TAN浸潤(rùn)程度與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)
　　結(jié)論：1.肺腺癌咯血與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯相關(guān);
　　2.中性粒細(xì)胞能誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生E

13、MT，TGF-β/Smad通路可能是其關(guān)鍵通路;
　　3.TAN能通過(guò)誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，可能是導(dǎo)致咯血肺腺癌預(yù)后不良的重要因素。
　　第三部分 癌巢內(nèi)TAN浸潤(rùn)誘導(dǎo)EMT促進(jìn)了食管鱗癌的不良預(yù)后
　　目的：1.明確食管鱗癌巢內(nèi)TAN的預(yù)后價(jià)值;
　　2.在局部炎癥反應(yīng)水平上探討TAN在食管鱗癌的作用機(jī)制。
　　方法：1.利用免疫組織化學(xué)技術(shù)評(píng)價(jià)癌巢內(nèi)CD66+ TAN的浸潤(rùn)情況

14、，腫瘤組織中TGF-β1和E-cadherin的表達(dá)水平;
　　2.利用體外共培養(yǎng)模型研究中性粒細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的相互作用;
　　3.Western blot檢測(cè)腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)指標(biāo)在蛋白水平的變化;
　　4.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的變化;
　　5.ELISA檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基上清中TGF-β1的變化;
　　6.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞的增值能力;
　　7

15、.利用K-M生存曲線和COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型研究TAN的預(yù)后價(jià)值。
　　結(jié)果：1.共有159名食管鱗癌患者并納入該研究;
　　2.食管鱗癌癌巢內(nèi)TAN浸潤(rùn)與隨訪過(guò)程中發(fā)生的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(Spearman秩相關(guān)系數(shù)=0.429，p＜0.001)、腫瘤組織中TGF-β1表達(dá)水平(Spearman秩相關(guān)系數(shù)=0.487，p＜0.001)、外周血中性粒細(xì)胞水平正相關(guān)(Spearman秩相關(guān)系數(shù)=0.432，p＜0.001);與腫瘤組織中E-

16、cadherin表達(dá)水平負(fù)相關(guān)(Spearman秩相關(guān)系數(shù)=-0.551，p＜0.001);
　　3.癌巢內(nèi)TAN浸潤(rùn)是食管鱗癌的獨(dú)立預(yù)后因素，多變量分析HR=2.453，95％CI，1.543-3.900;
　　結(jié)論：1.癌巢內(nèi)TAN浸潤(rùn)是食管鱗癌的獨(dú)立預(yù)后因素;
　　2.中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)其增值，是其促進(jìn)不良預(yù)后的重要因素。
　　關(guān)鍵詞:腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞;炎癥;食管鱗癌;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;

17、預(yù)后
　　第四部分 系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)為依據(jù)的LMR是肺癌的獨(dú)立預(yù)后因素:基于大數(shù)據(jù)的臨床資料分析
　　目的：1.在系統(tǒng)性炎癥水平上探討淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞比率(LMR)在行根治術(shù)后切除的肺癌患者中是否為獨(dú)立的預(yù)后因素;
　　2.明確LMR在NSCLC和小細(xì)胞肺癌(SCLC)中是否具有相同的預(yù)后價(jià)值。
　　方法：1.回顧性分析從2006年1月到2011年12月在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科接受根治性手術(shù)的原發(fā)性肺癌患者;<

18、br>　　2.收集患者術(shù)前外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算相應(yīng)的LMR;
　　3.以O(shè)S和DFS作為觀察終點(diǎn)，利用K-M生存曲線和COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行生存分析。
　　結(jié)果：1.共有1453名肺癌患者被納入該研究;
　　2.肺癌患者LMR與OS和DFS明顯相關(guān)。以O(shè)S為觀察終點(diǎn)時(shí)HR=1.522，95％CI:1.275-1.816;以DFS為觀察終點(diǎn)時(shí)HR=1.338，95％ CI:1.152-1.556;