腫瘤相關炎癥細胞的促腫瘤作用及機制研究.pdf

1、炎癥，是腫瘤的十大特征之一。炎性微環(huán)境對腫瘤的影響成為新的研究熱點。微環(huán)境中浸潤的白細胞包括肥大細胞、T細胞、髓源性抑制細胞、自然殺傷細胞、腫瘤相關中性粒細胞(TAN)和腫瘤相關巨噬細胞(TAM)等多種細胞亞型，他們是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分，并發(fā)揮了腫瘤促進或抑制的重要作用。
　　1.肺腺癌、咯血與炎癥
　　肺癌在世界范圍內居于癌癥相關死亡原因首位。肺癌患者最常見的癥狀包括咳嗽、呼吸困難、咯血等。盡管咯血是肺癌最常見的臨床

2、表現(xiàn)之一，但是治療前咯血的發(fā)生情況尚無確切數(shù)據(jù)，且咯血的機制也尚未明確，尤其是對于輕到中度咯血?？赡艿臋C制涉及新血管生成、血管侵犯、腫瘤壞死、侵襲過程或咳嗽引起的損傷等，我們通過回顧性分析，發(fā)現(xiàn)咯血是肺腺癌根治術后的獨立預后因素，腫瘤血管侵犯是咯血的重要原因，且咯血肺腺癌患者外周血中白細胞水平明顯增高。為了進一步明確炎癥、白細胞和腫瘤侵襲能力之間的相關性，我們進行了進一步的研究。
　　2.腫瘤相關炎癥
　　慢性炎癥是腫瘤微環(huán)

3、境中的一個固有的特點。腫瘤相關炎癥反應包括局部炎癥反應和系統(tǒng)性炎癥反應。巨噬細胞和中性粒細胞是浸潤到腫瘤組織中的重要的免疫細胞。他們參與集體的防御機制，在損傷或感染的情況下發(fā)揮重要的作用。在腫瘤局部炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用。在腫瘤微環(huán)境的影響下，巨噬細胞可以表現(xiàn)出經典的激活狀態(tài)（M1型）和選擇性激活狀態(tài)(M2)型并分別發(fā)揮抗腫瘤和促腫瘤的功能，在炎癥和腫瘤的相互作用中發(fā)揮著重要的作用，目前相關研究已經較深入。與之相比，中性粒細胞的相關

4、研究開展較晚。近來研究發(fā)現(xiàn)，與巨噬細胞類似，中性粒細胞在腫瘤微環(huán)境的調控下也能發(fā)揮抗腫瘤（N1型）或促腫瘤（N2型）的作用。其中TGF-β是巨噬細胞和中性粒細胞發(fā)生功能轉換的重要調控因子。
　　由于巨噬細胞和中性粒細胞特殊的促腫瘤作用，且肺腺癌咯血患者白細胞計數(shù)明顯增高，我們對肺腺癌外周血白細胞亞型中單核細胞和中性粒細胞進行了分析，并發(fā)現(xiàn)咯血患者中性粒細胞水平明顯增高，而單核細胞在咯血和非咯血患者中無明顯差異。
　　3.腫瘤

5、相關中性粒細胞(TAN)
　　循環(huán)中的中性粒細胞占白細胞的70％，在感染或者組織損傷時，它們被率先募集到病變部位，吞噬病原體，釋放不同的效應分子。微環(huán)境中腫瘤細胞和間質細胞能夠生成多種趨化因子，這些趨化因子被釋放進入血液循環(huán)，與中性粒細胞表面高表達的CXCR1和CXCR2受體結合，通過趨化作用募集中性粒細胞遷移到腫瘤區(qū)域，進而發(fā)揮至關重要的作用。然而臨床研究中的TAN的作用尚存在爭議，對相關文獻進行了綜述和meta分析，證實腫瘤內

6、中性粒細胞浸潤在頭頸部腫瘤、非小細胞肺癌、腎細胞癌中是獨立預后因素，然而在胃癌中，卻無預后價值。對于TAN在食管癌中發(fā)揮的作用和機制尚不明確，在進一步的研究中對TAN在食管鱗癌的以及咯血肺腺癌中的作用進行了相關研究。
　　4.TAN與上皮-間質轉換(EMT)
　　EMT是指有極性的上皮細胞轉化成間質細胞，是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程，也是上皮來源的腫瘤細胞獲得惡性表型的關鍵機制。EMT過程受

7、TGF-β、Ras、Wnt等多條信號通路調節(jié)，其中TGF-β信號通路是誘導EMT的經典通路之一。TGF-β通過Smad依賴性通路和多條Smad非依賴性通路共同參與EMT過程。
　　本課題將從咯血這一常見的臨床表現(xiàn)人手，探討咯血的預后價值及相關機制。并對研究中發(fā)現(xiàn)的咯血患者外周血白細胞水平明顯升高這一現(xiàn)象進行深入研究，在局部炎癥反應水平上探討腫瘤相關炎癥細胞的促腫瘤作用及可能機制，力圖明確TAN在咯血肺腺癌和食管鱗癌中的作用和相關機

8、制。此外，在系統(tǒng)性炎癥反應水平上證實LMR在肺癌的重要預后價值。這將為闡明腫瘤相關炎癥細胞的促腫瘤作用提供更為有利的依據(jù)。
　　第一部分 咯血是根治術后肺腺癌患者的獨立預后因素
　　目的：1.明確咯血在肺腺癌中的預后價值;
　　2.探討肺腺癌咯血的相關機制。
　　方法：1.對根治術后肺腺癌患者進行了回顧性研究，以總生存期(OS)、無病生存期(DFS)、疾病特異性生存期(DSS)做為觀察終點，分析了咯血的預后價值;

9、
　　2.探討引起咯血的可能機制:利用免疫組織化學技術對腫瘤組織VEGF的表達、腫瘤壞死、血管侵犯以及微血管密度情況進行評估分析;
　　3.分析咯血與臨床病理特征的相關性。
　　結果：1.咯血在根治術后肺腺癌患者中是不良OS，DSS及DFS(p值均＜0.001)的重要預測因素;
　　2.與非咯血組相比，咯血組腫瘤血管侵犯明顯，而VEGF表達、腫瘤壞死和腫瘤周圍微血管密度(MVD)兩組間無明顯差異;
　　結論

10、：1.咯血是根治術后肺腺癌患者的重要預后因素。
　　2.血管侵犯而不是血管生成或腫瘤壞死可能是肺腺癌患者咯血的最重要的機制。
　　第二部分 TAN促進肺腺癌細胞EMT
　　研究目的：1.明確咯血肺腺癌與外周血中白細胞亞型:中性粒細胞和單核細胞的相關性;
　　2.在局部炎癥反應水平探討腫瘤組織中TAN的作用。
　　方法：1.Mann-Whitney U檢驗法比較咯血和非咯血組肺腺癌患者外周血單核細胞和中性粒細

11、胞的分布差異;
　　2.利用免疫組織化學方法檢測肺腺癌腫瘤組織中CD66b+ TAN及腫瘤組織E-cadherin的表達水平;
　　3.建立中性粒細胞和肺腺癌細胞共培養(yǎng)模型，利用Western blot檢測腫瘤細胞EMT相關指標的表達情況;
　　4.利用ELISA檢測腫瘤細胞培養(yǎng)基上清中TGF-β1的變化，RT-PCR檢測TGF-β1的來源;
　　5.利用transwell遷移實驗檢測不同培養(yǎng)條件下腫瘤細胞運動能

12、力的變化。
　　結果：1.肺腺癌咯血與外周血中性粒細胞計數(shù)相關，與單核細胞計數(shù)無明顯相關性;
　　2.咯血與腫瘤組織中TAN浸潤有顯著的相關性，咯血組TAN浸潤機率明顯高于非咯血組(0R=4.25，95％ CI1.246-14.502);
　　3.腫瘤組織中CD66+ TAN浸潤程度與E-cadherin表達負相關
　　結論：1.肺腺癌咯血與中性粒細胞浸潤明顯相關;
　　2.中性粒細胞能誘導肺腺癌細胞發(fā)生E

13、MT，TGF-β/Smad通路可能是其關鍵通路;
　　3.TAN能通過誘導肺腺癌細胞發(fā)生EMT，促進腫瘤的侵襲和轉移，可能是導致咯血肺腺癌預后不良的重要因素。
　　第三部分 癌巢內TAN浸潤誘導EMT促進了食管鱗癌的不良預后
　　目的：1.明確食管鱗癌巢內TAN的預后價值;
　　2.在局部炎癥反應水平上探討TAN在食管鱗癌的作用機制。
　　方法：1.利用免疫組織化學技術評價癌巢內CD66+ TAN的浸潤情況

14、，腫瘤組織中TGF-β1和E-cadherin的表達水平;
　　2.利用體外共培養(yǎng)模型研究中性粒細胞和腫瘤細胞的相互作用;
　　3.Western blot檢測腫瘤細胞EMT相關指標在蛋白水平的變化;
　　4.Transwell遷移實驗檢測食管鱗癌細胞運動能力的變化;
　　5.ELISA檢測不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基上清中TGF-β1的變化;
　　6.MTT實驗檢測不同培養(yǎng)條件下腫瘤細胞的增值能力;
　　7

15、.利用K-M生存曲線和COX比例風險模型研究TAN的預后價值。
　　結果：1.共有159名食管鱗癌患者并納入該研究;
　　2.食管鱗癌癌巢內TAN浸潤與隨訪過程中發(fā)生的遠處轉移(Spearman秩相關系數(shù)=0.429，p＜0.001)、腫瘤組織中TGF-β1表達水平(Spearman秩相關系數(shù)=0.487，p＜0.001)、外周血中性粒細胞水平正相關(Spearman秩相關系數(shù)=0.432，p＜0.001);與腫瘤組織中E-

16、cadherin表達水平負相關(Spearman秩相關系數(shù)=-0.551，p＜0.001);
　　3.癌巢內TAN浸潤是食管鱗癌的獨立預后因素，多變量分析HR=2.453，95％CI，1.543-3.900;
　　結論：1.癌巢內TAN浸潤是食管鱗癌的獨立預后因素;
　　2.中性粒細胞誘導食管癌細胞發(fā)生EMT，促進其增值，是其促進不良預后的重要因素。
　　關鍵詞:腫瘤相關中性粒細胞;炎癥;食管鱗癌;上皮間質轉化;

17、預后
　　第四部分 系統(tǒng)性炎癥反應為依據(jù)的LMR是肺癌的獨立預后因素:基于大數(shù)據(jù)的臨床資料分析
　　目的：1.在系統(tǒng)性炎癥水平上探討淋巴細胞單核細胞比率(LMR)在行根治術后切除的肺癌患者中是否為獨立的預后因素;
　　2.明確LMR在NSCLC和小細胞肺癌(SCLC)中是否具有相同的預后價值。
　　方法：1.回顧性分析從2006年1月到2011年12月在山東大學附屬省立醫(yī)院胸外科接受根治性手術的原發(fā)性肺癌患者;<

18、br>　　2.收集患者術前外周血淋巴細胞計數(shù)和單核細胞計數(shù)，并計算相應的LMR;
　　3.以OS和DFS作為觀察終點，利用K-M生存曲線和COX比例風險模型進行生存分析。
　　結果：1.共有1453名肺癌患者被納入該研究;
　　2.肺癌患者LMR與OS和DFS明顯相關。以OS為觀察終點時HR=1.522，95％CI:1.275-1.816;以DFS為觀察終點時HR=1.338，95％ CI:1.152-1.556;