FoxP3對(duì)甲狀腺乳頭狀癌中NIS表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　甲狀腺乳頭狀癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其預(yù)后通常較好，十年生存率約達(dá)90％。甲狀腺癌術(shù)后，放射性碘治療是其常規(guī)后續(xù)治療手段，但一些病人表現(xiàn)出對(duì)放射性碘治療耐受。目前有大量文獻(xiàn)指出病人這種對(duì)放射性碘治療的耐受與位于甲狀腺細(xì)胞膜的鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium iodine symporter, NIS）表達(dá)下調(diào)有關(guān)。NIS介導(dǎo)了碘由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，為

2、甲狀腺激素的合成提供了原料，其表達(dá)主要受TSH的調(diào)控，TSH不僅能促進(jìn)NIS的表達(dá)水平，而且能使其正確定位于細(xì)胞膜上。除TSH外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（Transforming growth factor, TGF-β1），雌激素和碘在NIS的調(diào)節(jié)上也起著重要作用；其中，TGF-β1主要通過(guò)拮抗TSH的生物學(xué)效應(yīng)來(lái)發(fā)揮其抑制甲狀腺功能及 NIS表達(dá)的作用。Smads家族是一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，主要位于 TGF-β信號(hào)通路的下游發(fā)揮作用。T

3、GF-β1首先結(jié)合到細(xì)胞表面一種特異性激酶(TGF-βtype II receptor, TβR-II)上，從而導(dǎo)致了TβR-I的激活，后者又使R-Smad2和 R-Smad3磷酸化，磷酸化的R-Smad2和 R-Smad3繼而與Smad4共同轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)。
　　叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3（Forkhead box P3，F(xiàn)oxP3)是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(Tregs)生長(zhǎng)和分化的重要調(diào)節(jié)因子。一直以來(lái)都認(rèn)

4、為 FoxP3僅限定于 Treg細(xì)胞中特異性表達(dá)，直到Hanz在胰腺癌細(xì)胞中亦發(fā)現(xiàn)了它的表達(dá)，接下來(lái)在多種癌細(xì)胞株中都發(fā)現(xiàn)其有不同程度的表達(dá)。FoxP3在腫瘤細(xì)胞中能夠模仿其在Treg細(xì)胞中的功能，它通過(guò)促進(jìn)免疫抑制性細(xì)胞因子如 TGF-β1分泌來(lái)抑制腫瘤特異性 T細(xì)胞，從而使腫瘤逃離機(jī)體的免疫監(jiān)視。此外，有研究顯示 FoxP3高表達(dá)和病人對(duì)放射性碘治療抵抗有關(guān)。
　　由于病人對(duì)放射性碘治療的耐受與NIS表達(dá)下調(diào)有關(guān)，且FoxP3

5、在多種腫瘤中都能促進(jìn)TGF-β1分泌，而TGF-β1又是NIS表達(dá)強(qiáng)有力的抑制因子，因此推測(cè)FoxP3可能通過(guò)誘導(dǎo) TGF-β1信號(hào)通路的激活來(lái)下調(diào)NIS的表達(dá)。在本研究中，采用免疫組織化學(xué)和熒光定量PCR檢測(cè)90例甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本和40例正常甲狀腺組織中 FoxP3和 NIS的表達(dá)。此外，本研究組成性激活型（Constitutively active，CA）FoxP3過(guò)表達(dá)慢病毒載體來(lái)上調(diào)FoxP3的表達(dá)及活性，觀察在甲狀腺乳頭狀癌

6、細(xì)胞中FoxP3對(duì)NIS表達(dá)水平的影響。
　　目的：
　　1．探討FoxP3與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征及NIS表達(dá)的關(guān)系；
　　2．觀察FoxP3對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中NIS表達(dá)的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法：
　　1.采用免疫組織化學(xué)和熒光定量PCR檢測(cè)90例甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本和40例取自癌對(duì)側(cè)葉的正常甲狀腺組織中FoxP3和NIS的表達(dá)。
　　2.人甲狀腺乳頭癌細(xì)胞株TPC-1于含

7、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用不同濃度的人重組TGF-β1(1,5,10 ng/mL)處理后，Real-time PCR檢測(cè)NIS mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)其蛋白水平的表達(dá)。
　　3.構(gòu)建含組成性激活型（Constitutively active，CA）FoxP3編碼序列的慢病毒載體（LV-CA-FoxP3）及空慢病毒載體（LV-NC-GFP），并轉(zhuǎn)染于TPC-1，倒置熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)，流式

8、細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　4.將細(xì)胞分為對(duì)照(NC)組，過(guò)表達(dá) FoxP3(LV-CA）組及空病毒載體（LV-NC）組，Real-time PCR檢測(cè)FoxP3和TGF-β1的mRNA表達(dá)；Western blot檢測(cè)FoxP3, TGF-β1及TGF-β1通路下游重要成員TβR-I, Smad3和pSmad3的蛋白表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)FoxP3, TβR-I和Psmad3的表達(dá)；ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的TGF-β1水平。

9、r>　　5.將細(xì)胞分為對(duì)照組，LV-CA組，LV-CA加不同濃度的 TGF-β1單克隆抗體組（1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L）以及LV-NC組，Real-time PCR檢測(cè)六組細(xì)胞NIS mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1．免疫組化結(jié)果顯示FoxP3在甲狀腺乳頭狀癌中的陽(yáng)性率為74%，而在正常組織中均為陰性表達(dá)，且FoxP3與甲狀腺外侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05

10、)有關(guān)。
　　2．在正常甲狀腺組織中NIS主要定位于細(xì)胞膜，在腫瘤組織中其表達(dá)顯著減少，尤其在FoxP3陽(yáng)性的樣本中，并且這些低表達(dá)的NIS主要定位于胞漿中。
　　3．免疫組化結(jié)果顯示甲狀腺乳頭癌中FoxP3陽(yáng)性患者的NIS表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于FoxP3陰性患者（P<0.05）。Real-time PCR結(jié)果顯示甲狀腺乳頭癌中FoxP3陽(yáng)性患者NIS的mRNA水平顯著低于FoxP3陰性患者（P<0.05）。
　　4.與對(duì)

11、照組相比，隨著培養(yǎng)基中TGF-β1濃度的增加，NIS的mRNA和蛋白表達(dá)均逐漸減少；當(dāng)TGF-β1的濃度達(dá)到最大（10 ng/mL）時(shí)，NIS的mRNA和蛋白含量分別下降至對(duì)照組的6倍和2倍。
　　5．倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示 LV-CA和 LV-NC組細(xì)胞中表達(dá)大量的GFP，而未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞不表達(dá)。流式細(xì)胞儀顯示對(duì)照組，LV-CA-FoxP3組和LV-NC組的GFP陽(yáng)性率即轉(zhuǎn)染效率分別為0.2%，99.3%和99.3%。

12、　　6．與對(duì)照組相比，LV-CA組FoxP3和TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05）；ELISA結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，LV-CA組細(xì)胞上清液中TGF-β1的分泌顯著增加（P<0.05）；Western blot結(jié)果顯示LV-CA組TβR-I和pSmad3的蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加（P<0.05），而Smad3無(wú)明顯變化。
　　7．免疫熒光結(jié)果顯示，F(xiàn)oxP3在LV-CA組細(xì)胞中大量表達(dá)，且主要位于細(xì)胞核中，而在正

13、常組和 LV-NC組細(xì)胞中 FoxP3的表達(dá)量則很低。與正常組和LV-NC組細(xì)胞相比，LV-CA組細(xì)胞的TβR-I和pSmad3表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，而Smad3的表達(dá)在三組細(xì)胞間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　8．與NC組相比，LV-CA-FoxP3組NIS的 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，但隨著TGF-β1單克隆抗體濃度的不斷增加，NIS的mRNA及膜蛋白表達(dá)均逐漸恢復(fù)至接近正常。
　　結(jié)論：
　　1.FoxP