使用全基因組外顯子測序探尋I型點(diǎn)狀掌跖角化病和播散淺表性光化性汗孔角化病致病基因.pdf

1、研究背景：點(diǎn)狀掌跖角化病(Punctate palmoplantar keratoderma,PPKP)為一組病因復(fù)雜的常染色體顯性遺傳性皮膚病。其主要臨床表現(xiàn)為分布于掌跖部位的圓形或卵圓形的硬性角質(zhì)性丘疹,可以融合成片。根據(jù)連鎖定位區(qū)域和臨床特征的不同,人類孟德爾遺傳在線(Online Mendelian inheritance in Man database,OMIM)收錄了PPKP的3種不同類型,分別為連鎖定位區(qū)域?yàn)?5q22的P

2、PKP1(Buschke-Fischer-Brauer type; MIM148600),目前無任何定位信息的PPKP2(Porokeratotic type; MIM175860)以及定位于2p25–p12染色體區(qū)域的PPKP3(Acrokeratoelastoidosis type; MIM101850)。2004年,本課題組在一個(gè)中國漢族人PPKP1家系中定位了染色體區(qū)域15q22.2-15q22.31與本病相關(guān)。
　　播散

3、淺表性光化性汗孔角化癥(Disseminated superficial actinic porokeratosis,DSAP)是一組以環(huán)狀排列的異常角化性皮損為特征表現(xiàn),主要發(fā)生在曝光部位的常染色體顯性遺傳性皮膚病,它是汗孔角化癥中最為常見的一種類型。通過傳統(tǒng)的以家系為基礎(chǔ)的全基因組連鎖分析研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5個(gè)DSAP的易感區(qū)域:12q23.2-24.1,12q24.1-q24.2,15q25.1-26.1,1p31.3-p31.1和1

4、6q24.1-24.3。2012年,本課題組使用全基因組外顯子測序在一中國漢族DSAP家系中首次發(fā)現(xiàn)了MVK致病基因。同時(shí)在另外的18個(gè)DSAP家系和4個(gè)DSAP散發(fā)病例中檢測出MVK基因的13種突變形式。DSAP表現(xiàn)很強(qiáng)的異質(zhì)性,在所有選入研究的DSAP病例中,仍有很大一部分未能成功克隆出致病基因。
　　目前,全基因組外顯子測序在單基因病致病基因研究中被廣泛應(yīng)用,它具有所需樣本少,周期短,覆蓋面廣和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)發(fā)展成為發(fā)

5、現(xiàn)小樣本罕見遺傳病致病基因的最有效手段。
　　目的：對定位于染色體15q22.2-15q22.31區(qū)域的點(diǎn)狀掌跖角化病和非MVK基因致病性的播散淺表性光線性汗孔角化癥使用全基因組外顯子測序進(jìn)行研究。(2)全基因組外顯子測序發(fā)現(xiàn)的候選基因在更多樣本中進(jìn)行驗(yàn)證,確認(rèn)致病基因。
　　方法：(1)分別從安徽醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所遺傳資源庫中選擇具有典型臨床表現(xiàn)的點(diǎn)狀掌跖角化病和播散淺表性光化性汗孔角化癥家系樣本和散發(fā)病例。在之前定位過

6、染色體15q22.2-15q22.31區(qū)域的點(diǎn)狀掌跖角化病家系中選擇1例患者和1例正常對照。在1例未能克隆出MVK基因的播散淺表型光線性汗孔角化癥家系中選擇2例患者和1例對照,抽提外周血DNA。(2)純化后的基因組DNA被隨機(jī)打斷來建立DNA文庫,在DNA片段兩端接上接頭后進(jìn)行純化。(3)使用接頭連接DNA片段做為模板進(jìn)行連接介導(dǎo)的PCR,使用SureSelect Biotiny lated RNA Library對外顯子片段進(jìn)行富集,

7、并洗脫。(4)使用HiSeq2000高通量測序儀對富集過后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙末端測序,得到最初的原始圖像文件。(5)使用Illumina basecalling Software1.7軟件對原始圖像文件讀取,并使用SOAPaligner2.20軟件與人類參照基因組(NCBI build37.3,hg19)進(jìn)行比對。(6)分別通過SOAPsnp(v1.03),GATK(Genome analysis toolkit)識(shí)別SNP和插入/缺失

8、變異。(7)通過與dbSNP137,1000 Genome,HapMap,內(nèi)部數(shù)據(jù)庫以及病例對照比對等方式過濾掉常見變異。(8)首先選擇位于連鎖定位區(qū)域內(nèi)的候選變異位點(diǎn),在其它樣本中使用Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證。(9)如果原連鎖區(qū)域內(nèi)未找到變異位點(diǎn)或在外顯子組測序家系內(nèi)未能驗(yàn)證出基因型-表型共分離位點(diǎn),將篩選范圍擴(kuò)大至整個(gè)外顯子組,使用功能預(yù)測軟件如SIFT,PolyPhen來選擇可能有害變異位點(diǎn)在其它樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：

9、5例樣本進(jìn)行全基因組外顯子測序所獲得的靶向外顯子組覆蓋度達(dá)到98～％,平均測序深度達(dá)到70×~,每例樣本在與人類參考基因組比對注釋之后能夠平均得到1.35×105個(gè)功能性變異,與其它常見變異數(shù)據(jù)庫以及病例對照篩查之后,在PPKP1家系和DSAP家系分別得到527和233個(gè)變異位點(diǎn)。
　　在PPKP1-1家系中我們發(fā)現(xiàn)位于5個(gè)基因上的5個(gè)變異位點(diǎn)位于定位區(qū)域15q22.2-15q24.1內(nèi),Sanger測序確定該定位區(qū)域內(nèi)AAGAB

10、基因上的c.552_554TAG>AT(p.Phe184Leufs*6)變異為該家系致病變異。隨后在4個(gè)獨(dú)立家系以及1例散發(fā)病例中發(fā)現(xiàn)了AAGAB基因的5種突變形式,驗(yàn)證了AAGAB致病基因。
　　篩選DSAP的連鎖區(qū)域內(nèi)的變異位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)了位于4個(gè)基因上的4個(gè)變異,在家系內(nèi)使用Sanger測序進(jìn)行基因分型,由于不符合表型一致性而全部排除。進(jìn)而將篩查范圍擴(kuò)大至外顯子組,使用SIFT,Polyphen軟件進(jìn)行預(yù)測,獲得了25個(gè)可能有害

11、的變異位點(diǎn),在家系內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)位于SLC17A9基因上的c.932G>A(p.Arg311Gln)在家系內(nèi)符合基因型表型共分離。在未攜帶MVK基因變異的DSAP患者中選擇7個(gè)獨(dú)立家系(Family1-7)和19例散發(fā)對SLC17A9基因的所有編碼外顯子以及側(cè)翼序列進(jìn)行測序,在Family2家系內(nèi)發(fā)現(xiàn)了SLC17A9基因的第二種變異c.25C>T(p.Arg9Cys),驗(yàn)證了SLC17A9致病基因。
　　結(jié)論：本研究利用全基因組