氯離子通道蛋白CLICs及其突變體與Sedlin相互作用的初步研究.pdf

1、目的：為了研究胞內(nèi)氯離子通道蛋白 CLICs及其突變體與遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良病蛋白Sedlin的相互作用，運用分子克隆技術(shù)構(gòu)建下游為FLAG標簽的CLICs及其突變體的真核表達質(zhì)粒。通過瞬時轉(zhuǎn)染，免疫熒光實驗，免疫印跡和 GST pulldown實驗等研究蛋白質(zhì)的共定位及相互作用情況，探索CLIC家族的生物學功能。
　　方法：以 pcDNA3-CLIC1-FLAG重組質(zhì)粒為模板，運用分子克隆技術(shù)構(gòu)建真核表達質(zhì)粒 pcDNA3-C

2、LIC1(C24A)-FLAG、 pcDNA3-CLIC1(C59A)-FLAG、pcDNA3-CLIC1(C24A-C59A)-FLAG、pcDNA3-CLIC1(△49-51)-FLAG；以 CLIC2全長 cDNA序列為模板，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒 pcDNA3-CLIC2-FLAG、pcDNA3-CLIC2(C30A)-FLAG；以pcDNA3-CLIC3-FLAG重組質(zhì)粒為模板，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3-CLIC3(C22A)-

3、FLAG；以 pcDNA3-CLIC4-FLAG重組質(zhì)粒為模板，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3-CLIC4(C35A)-FLAG；以CLIC5全長cDNA序列為模板，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒 pcDNA3-CLIC5(C32A)-FLAG。將真核表達質(zhì)粒單轉(zhuǎn)染入 COS7細胞，觀察其細胞定位，再將 CLICs及其突變體真核表達質(zhì)粒與pCDGFP-Sedlin共同轉(zhuǎn)染入COS7細胞中，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察兩種蛋白在細胞內(nèi)的共定位情況；將CLI

4、Cs全長及其突變體轉(zhuǎn)染入HEK293T細胞中，提取細胞總蛋白，利用Western blot法檢測蛋白表達情況；pGEX-5X-3-SEDL轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細胞中，制備融合蛋白，同時分別轉(zhuǎn)染CLICs全長及其突變體真核表達質(zhì)粒到HEK293T細胞中，通過GST pulldown技術(shù)檢測其在體外相互作用情況。
　　結(jié)果：酶切鑒定和測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了實驗相關(guān)的重組質(zhì)粒及突變體；Western blotting結(jié)果顯示CLIC1及

5、其三個點突變體蛋白在HEK293T細胞中均能表達，CLIC2、CLIC3及CLIC4同樣均能表達；免疫熒光實驗表明，CLIC1主要定位在細胞核，胞質(zhì)也有表達；CLIC1點突變體蛋白定位在胞質(zhì)中，細胞核中無分布；CLIC1缺失突變體蛋白定位在胞質(zhì)中，核有少量表達；CLIC2在細胞核及胞質(zhì)均有定位；CLIC2點突變體蛋白定位發(fā)生明顯變化，有少量熒光且呈現(xiàn)點狀分布；CLIC3、CLIC4主要定位在胞質(zhì)中，細胞核有少量分布；CLIC5蛋白定位在

6、胞質(zhì)中，細胞核中無分布；CLIC3點突變體蛋白定位在胞質(zhì)中，核有少量表達；CLIC4點突變體蛋白定位在胞質(zhì)中，細胞核有少量分布；CLIC5點突變體蛋白主要定位在胞質(zhì)中，細胞核無分布；CLIC1、CLIC2與Sedlin蛋白在胞質(zhì)、胞核均有共定位；CLIC1點突變體與Sedlin蛋白只在胞質(zhì)存在共定位；CLIC2點突變體與Sedlin蛋白不存在共定位；CLIC3與Sedlin蛋白在胞質(zhì)存在共定位；CLIC3點突變體與Sedlin蛋白在胞質(zhì)

7、存在共定位。GST pulldown實驗表明野生型CLICs蛋白都和Sedlin蛋白存在相互作用，證明CLIC1點突變體與GST-Sedlin蛋白之間沒有互作關(guān)系。
　　結(jié)論： CLIC1及其點突變體、CLIC2、CLIC3及其點突變體與Sedlin蛋白均存在共定位；CLIC1及其三種點突變體，CLIC(2-4)均能在哺乳動物細胞中有效表達并且野生型CLIC(1-5)都和Sedlin蛋白存在相互作用，但CLIC1點突變體與后者不存