轉(zhuǎn)移抑制因子nm23-H1與Ras-to-MAPK通路支架蛋白KSR氨基端突變體相互作用的研究.pdf

1、背景與目的:近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)世界上許多國(guó)家和地區(qū)，肺癌的發(fā)病率和死亡率均持續(xù)上升，成為威脅人類(lèi)生命健康最大的惡性腫瘤。侵襲轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標(biāo)志和特征，也是導(dǎo)致患者治療失敗和死亡的主要原因。肺癌侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因和多步驟發(fā)展過(guò)程，可涉及細(xì)胞多個(gè)信號(hào)通路的改變，正是由于某些細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵基因結(jié)構(gòu)或功能異常，激活或抑制了細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致了肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移表型的表達(dá)。nm23-H1是肺癌的轉(zhuǎn)移抑制基因，在調(diào)節(jié)肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)

2、程中，對(duì)調(diào)控與“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級(jí)聯(lián)”相關(guān)的一系列下游基因具有重要的作用。Ras-to-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路普遍存在，在許多生長(zhǎng)和發(fā)育信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵的作用，并且通過(guò)Ras激活一系列細(xì)胞質(zhì)激酶Raf，MEK和MAPK并傳遞信號(hào)。在Ras-to-MAPK通路中Ras激酶抑制基因(KSR)是在1995年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，其功能是作為支架蛋白為組裝Ras下游關(guān)鍵信號(hào)形成多蛋白復(fù)合體提供一個(gè)可利用的磷酸化反應(yīng)支架，從而加速M(fèi)APK通路的信號(hào)傳導(dǎo)。周

3、清華教授為首的課題組前期研究探討了nm23-H1與KSR相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)nm23-H1磷酸化KSR和KSR氨基端，而不磷酸化其羧基端。證實(shí)nm23-H1具有組氨酸激酶活性，從而推測(cè)nm23-H1可通過(guò)改變支架蛋白KSR的磷酸化狀態(tài)影響Ras-to-MAPK通路的信號(hào)傳導(dǎo)。目前尚不能確定nm23-H1基因調(diào)控KSR的分子靶點(diǎn)，以及nm23-H1與突變后KSR相互作用對(duì)nm23-H1調(diào)控肺癌轉(zhuǎn)移有何影響?因此通過(guò)應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建不同K

4、SR片斷，研究不同KSR片斷與nm23-H1蛋白相互作用關(guān)系；根據(jù)nm23-H1蛋白磷酸化KSR片斷的位置不同，應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)選擇可能的KSR磷酸化位點(diǎn)，在已知KSR基因DNA序列中準(zhǔn)確地取代該位點(diǎn)堿基獲得突變體蛋白質(zhì)，研究突變后KSR蛋白與nm23-H1蛋白相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步闡明“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級(jí)聯(lián)”的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法:(1)．應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pET28a-nm23-H1表達(dá)載體，表達(dá)nm23

5、-H1蛋白，應(yīng)用親和層析的方法純化蛋白，以及Western blot和放射自顯影的方法研究nm23-H1蛋白的生物學(xué)活性；(2)．應(yīng)用基因重組技術(shù)從pCMV-Tag2b-KSR載體上構(gòu)建出pCMV-Tag2b-N-296-KSR真核表達(dá)載體，測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果。將pCMV-Tag2b-KSR、pCMV-Tag2b-N-KSR，pCMV-Tag2b-N-296-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR四種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T、細(xì)胞，獲得：K

6、SR，N-KSR，N-296-KSR和C-KSR融合蛋白，可以通過(guò)Westernblot鑒定目的蛋白。體外激酶活性分析自磷酸化的nm23-H1蛋白與不同長(zhǎng)度KSR、N-296-KSR，N-KSR和C-KSR之間磷酸化的關(guān)系；(3)．應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的定點(diǎn)突變技術(shù)分別構(gòu)建了全長(zhǎng)6950bp pCMV-Tag2b-KSR氨基端9個(gè)位點(diǎn)，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞株表達(dá)蛋白；(4)．應(yīng)用親和膠純化KSR突變蛋白，應(yīng)用體外激酶活性實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)野生型

7、自磷酸化nm23-H1與KSR突變體蛋白是否發(fā)生相互作用，從而尋找可能的nm23-H1磷酸化KSR位點(diǎn)。 結(jié)果:本研究觀察到：(1)本研究成功將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pET28a-nrn23-H1原核表達(dá)載體表達(dá)出了原核蛋白，應(yīng)用親和層析的方法純化nm23-H1蛋白，用放射自顯影的方法證實(shí)原核表達(dá)蛋白具有自身磷酸化生物學(xué)活性并且表達(dá)的目的蛋白能夠通過(guò)Western blot鑒定。(2)本研究從pCMV-Tag2b-KSR載體上成功構(gòu)建出

8、pCMV-Tag2b-KSR-296片段真核表達(dá)載體；并成功地將其真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得FLAG-N-KSR-296片段融合蛋白，目的蛋白可以通過(guò)Westem blot鑒定。(3)體外激酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自磷酸化的nm23-H1不能磷酸化N-296-KSR和羧基端，據(jù)此可以推測(cè)nm23-H1磷酸化KSR在N-296和N-538之間，這個(gè)位置主要集中在KSR的CA3、CA4區(qū)域之間。(4)本研究應(yīng)用改良的QuikChange<'

9、TM>方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，成功構(gòu)建了9個(gè)突變型pCMV-Tag2b-KSR質(zhì)粒：pCMV-Tag2b-KSR<'S297A>、pCMV-Tag2b-KSR<'S392A>、pCMV-Tag2b-KSR<'A431A>、pCMV-Tag2b-KSR<,S434A>、pCMV-Tag2b-KSRS|<'S435A>、pCMV-Tag2b-KSR<'S438A>、pCMV-Tag2b-KSR<,S439A>、pCMV-Tag2b-KSR|<'S

10、442A>，pCMV-Tag2b-KSR<'S443A>。經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染出目的蛋白、純化后并進(jìn)行westem blot檢測(cè)鑒定。(5)體外激酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：自磷酸化的nm23-H1與KSR突變體蛋白發(fā)生作用，在FLAG-KSR<'S297A>、FLAG-KSR<'S392A>、FLAG-KSR<'S431A>、FLAG-KSR<'S435A>、FLAG-KSR<'S438A>、FLAG-KSR<'S442A>

11、，F(xiàn)LAG-KSR<'S443A>8個(gè)突變體放射自顯影圖中可見(jiàn)有磷酸化條帶，而FLAG-KSR<'S439A>突變蛋白沒(méi)有出現(xiàn)磷酸化條帶，F(xiàn)LAG-KSR<'S434A>、FLAG-KSR<'S297A>可以被磷酸化，但是磷酸化條帶很弱，該結(jié)果說(shuō)明發(fā)生突變的KSR絲氨酸297、392、431、435、438、442、443位點(diǎn)不是nm23-H1磷酸化位點(diǎn)，而絲氨酸439位點(diǎn)是nm23-H1磷酸化位點(diǎn)。 結(jié)論:(1)成功表達(dá)出具有

12、活性的野生型nm23-H1蛋白；(2)成功構(gòu)建pCMV-Tag2b-KSR-N-296片段真核表達(dá)載體，并獲得該片段融合蛋白；(3)成功構(gòu)建pCMV-Tag2b-KSR氨基端9個(gè)突變位點(diǎn)真核表達(dá)載體獲得9個(gè)突變體蛋白：FLAG-KSR<'S297A>、FLAG-KSR<'S392A>、FLAG-KSR<'S431A>、FLAG-KSR<'S434A>、FLAG-KSR<'S435A>、FLAG-KSR<'S438A>、FLAG-KSR<

13、'S439A>、FLAG-KSR<'S442A>，F(xiàn)LAG-KSR<'S443A>；(4)證實(shí)自磷酸化的nm23-H1可以磷酸化KSR，它們之間存在磷酸化關(guān)系，在研究發(fā)現(xiàn)9個(gè)突變體蛋白中除KSR<'S439A>未發(fā)生磷酸化以外，其它8個(gè)蛋白均發(fā)生了磷酸化反應(yīng)，據(jù)此推測(cè)nm23-H1調(diào)控KSR的分子靶點(diǎn)可能位于KSR氨基端的絲氨酸439位點(diǎn)，nm23-H1可影響KSR磷酸化水平，nm23-H1抑制肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)理可能與KSR的磷酸化功能狀態(tài)