EBI3蛋白與Sedlin蛋白相互作用的研究.pdf

1、目的：為研究EBI3蛋白的生物學(xué)功能,構(gòu)建帶有FLAG標(biāo)簽的EBI3、帶GFP標(biāo)簽的EBI3和帶有HA標(biāo)簽的EBI3真核表達(dá)載體,瞬時轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞,觀察表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位;將EBI3與Sedlin真核表達(dá)載體質(zhì)粒共同瞬時轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞,觀察各組蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況;將EBI3與Sedlin共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,用免疫共沉淀實驗檢測EBI3蛋白與Sedlin蛋白在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的相互作用情況。
　　方法：

2、用PCR方法,以含人EBI3全長cDNA序列的質(zhì)粒pGBKT7-EBI3為模板,擴(kuò)增EBI3全長序列,酶切回收目的片段,插入到載體pCDNA3.1、pCDGFP上,構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1-EBI3-FLAG、pCDGFP-EBI3和pCDNA3.1-EBI3-HA。用PCR方法,用引入了點突變的引物,以pCDNA3.1-EBI3-FLAG為模板,構(gòu)建表達(dá)載體pCDNA3.1-D210A-FLAG。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確的送測序

3、公司測序。
　　分別將pCDNA3.1-EBI3-FLAG和pCDGFP-EBI3質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察各種蛋白的細(xì)胞定位;pCDNA3.1-EBI3-FLAG、pCDGFP-EBI3分別與pCDGFP-Sedlin、pCDNA3.1-Sedlin-FLAG共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察各組蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位;將EBI3與Sedlin共同瞬時轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,通過免疫共沉淀實驗檢測EBI

4、3蛋白與Sedlin蛋白在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
　　結(jié)果：經(jīng)過酶切和測序鑒定,證明各質(zhì)粒均構(gòu)建正確。pCDNA3.1-EBI3-FLAG轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察到,EBI3蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,核內(nèi)分布不明顯;pCDGFP-EBI3轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,也可觀察到相同的結(jié)果。pCDNA3.1-EBI3-FLAG與pCDGFP-Sedlin共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,免疫熒光顯微鏡觀察到,EBI3與Sedlin在

5、細(xì)胞質(zhì)中有部分共定位。pCDGFP-EBI3與pCDNA3.1-Sedlin-FLAG共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,免疫熒光顯微鏡觀察到,EBI3與Sedlin共定位主要在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核也可見部分共定位,共定位情況與pCDNA3.1-EBI3-FLAG與pCDGFP-Sedlin的共定位基本相同。pCDNA3.1-EBI3-FLAG與pCDGFP-Sedlin免疫共沉淀實驗表明,在HEK293T細(xì)胞中,EBI3蛋白與Sedlin蛋白存在相