FKBP25及其缺失突變體與CLIC1相互作用的研究.pdf

1、目的:為進一步了解哺乳動物細胞中FKBP25蛋白的生物學功能,構建下游帶FLAG標簽的FKBP25缺失突變體FKBP25-FLAG-N和FKBP25-FLAG-C真核表達質粒。分別將FKBP25及兩個缺失突變體表達質粒轉染至COS7細胞中,觀察各組蛋白單獨表達時在細胞內的定位情況;分別將帶不同標簽的FKBP25與CLIC1表達質粒共轉染至COS7細胞和HEK293T細胞中,通過免疫熒光方法觀察各組蛋白在細胞內的共定位情況;免疫共沉淀方法

2、檢測各組蛋白在細胞內的相互作用情況。
　　方法:以pCDNA3.1-FKBP25-FLAG重組質粒為模板,用PCR方法構建pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-N和pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-C真核表達質粒。重組質粒經雙酶切鑒定正確后送去測序。采用脂質體法進行細胞轉染,將帶不同標簽的FKBP25和CLIC1質粒單獨轉染至COS7細胞中,利用細胞免疫熒光技術研究各組蛋白單轉定位變化;將pCDNA3.1-FKBP25

3、-FLAG及兩個缺失突變體、pCDGFP-FKBP25質粒分別與帶不同標簽CLIC1質粒共轉染至COS7細胞中,在熒光顯微鏡下觀察各組蛋白在哺乳動物細胞內共定位情況;分別將pCDGFP-FKBP25、pCDNA3.1-FKBP25-FLAG兩個缺失突變體質粒和帶不同標簽的CLIC1質粒共轉染至HEK293T細胞中,通過免疫共沉淀方法檢測FKBP25及兩個缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白在哺乳動物細胞內的是否相互作用。
　　結果:經酶

4、切和測序結果鑒定,重組質粒構建成功。免疫熒光顯微鏡觀察 FKBP25蛋白主要分布在細胞質,細胞核也有一定分布;兩個缺失突變體蛋白的定位沒有變化。CLIC1蛋白主要分布在細胞核,核膜處也有分布,細胞質內次之。共定位觀察FKBP25及兩個缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白在COS7細胞中主要分布在細胞質,核膜及細胞核內少量分布。免疫共沉淀檢測 FKBP25及pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-N蛋白和CLIC1蛋白在HEK293T細胞中存