環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒和捷申病毒感染對IPEC-J2細胞的影響及機制研究.pdf

1、環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒和捷申病毒被發(fā)現(xiàn)均與腹瀉密切相關，且存在著共感染現(xiàn)象，在豬腸道病毒流行病學上越來越引起人們的關注和重視。環(huán)曲病毒屬于冠狀病毒的一種，在本課題中被用來研究冠狀病毒引起的豬亞臨床腸道疾病所致腸道細胞機能變化。薩佩羅病毒和捷申病毒同屬于小RNA病毒科，在本研究中被作為引起豬臨床和亞臨床腹瀉綜合征的小RNA病毒代表，探討腸道感染病毒所致的腸道細胞機能變化。LOX-1（Lectin-like oxidized low-dens

2、ity lipoprotein-1），作為Ox-LDL的受體，參與機體脂質(zhì)代謝，促進機體炎癥反應，影響細胞的生長分裂和細胞骨架結構，導致組織損傷，反應機體的疾病病理狀態(tài)，被本實驗室先前研究發(fā)現(xiàn)在薩佩羅病毒感染小腸絨毛上皮細胞（IPEC-J2）的病理過程中呈現(xiàn)明顯上調(diào)。目前關于不同種屬腸道病毒的比較性研究很少，也未見關于環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒或捷申病毒引起腸道細胞機能性變化的相關研究。同時，LOX-1雖被證實與人的炎癥相關病理變化甚至是癌癥

3、發(fā)生有關，但是，LOX-1是否在病毒引起的慢性炎癥反應中發(fā)揮一定的作用還未可知。因此，我們擬在探究環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒和捷申病毒感染IPEC-J2細胞引起的細胞病理發(fā)生過程的基礎上，進一步探討 LOX-1在腸道病毒感染腸道細胞過程中發(fā)揮的潛在作用及其信號功能。
　　1.環(huán)曲病毒的鑒定
　　流行病學調(diào)查顯示，環(huán)曲病毒在上海地區(qū)有流行，感染率為5.5%。在牛環(huán)曲病毒基因組全長的基礎上，我們獲得了豬環(huán)曲病毒的全長基因組序列（283

4、01bp），進一步擴充了環(huán)曲病毒的有限基因組信息。全長序列中堿基的缺失和替換主要發(fā)生在非結構基因 ORF1a上。和牛環(huán)曲病毒及馬環(huán)曲病毒相比，豬環(huán)曲病毒SH1株分別缺失了28個堿基和152個堿基。將陽性糞便樣品回歸感染巴馬小型豬，可觀察到環(huán)曲病毒在感染豬上周期性隨糞便排出，每5~6天為一個病毒復制和排毒周期。環(huán)曲病毒還會引起同居感染。未感染豬接觸感染豬3天以上則可被感染并出現(xiàn)排毒現(xiàn)象。這說明通過糞便途徑采集樣品時，一部分感染豬可能處于非

5、排毒期。因此我們認為實際豬場中的環(huán)曲病毒感染率應該更高。
　　2.捷申病毒的分離鑒定
　　捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）在上海地區(qū)的感染率高達82.2%以上。VP1分型結果顯示，除了主要血清型4、8和10外，新血清型PTV wild boar/WB2C-TV/2011/HUN流行程度也較高，血清型3和另一血清型PTV SH8比較少。本研究分離出上海主要流行株PTV4 SH1。PTV4 SH1和PT

6、V410BJ02相似度最高，序列一致性高達90%。但是，相對于PTV410BJ02，PTV SH1的VP2蛋白缺失了4個氨基酸序列。SH1株的5’端與PTV8 Jinlin/2003/02和PTV8 Fuyu/2009/02非常一致，都缺乏其他株基因組中的poly（C）序列。
　　3.環(huán)曲病毒感染對IPEC-J2細胞機制的影響
　　本研究應用豬環(huán)曲病毒的木瓜樣蛋白酶和3C樣蛋白酶來對環(huán)曲病毒進行功能分析。木瓜樣蛋白酶在 IP

7、EC-J2細胞中主要分布于細胞核區(qū)，3C樣蛋白酶主要定位于細胞質(zhì)。蛋白酶的表達會導致細胞的凋亡，誘導微絲的解聚和消融，細胞骨架發(fā)生重排，細胞周期被完全阻礙在G2/M期。在蛋白酶過表達的IPEC-J2細胞中，細胞內(nèi)NO水平提高，胞漿內(nèi)活性氧水平下降，但線粒體內(nèi)活性氧水平上升。蛋白酶還能夠促進IFN-α、TNF-α，IL-1α和TGF-β的mRNA水平升高，上調(diào) LOX-1，STAT2和 RIG-I的轉錄水平。同時，環(huán)曲病毒蛋白酶過表達細胞

8、中LOX-1和STAT2的蛋白表達增加。但是RIG-I的蛋白表達可被蛋白酶所抑制。
　　4.薩佩羅病毒感染對IPEC-J2細胞機制的影響
　　薩佩羅病毒的感染能夠引起IPEC-J2細胞的漸進性變化。在病毒復制的前期，少量細胞發(fā)生凋亡；感染24h后，大量細胞開始進入后期凋亡或發(fā)生壞死。病毒感染的末期，細胞周期多數(shù)停留在G2/M期，細胞內(nèi)氧化應激水平和NO生成呈爆發(fā)式增長。在病毒感染的過程中，宿主細胞骨架發(fā)生重排，應力纖維結構遭

9、到破壞，微絲聚集變粗，并逐漸向細胞邊界聚攏。細胞內(nèi)的一系列炎癥相關細胞因子也發(fā)生明顯變化。TNF-α轉錄水平急劇提升，IFN-α，TGF-β，NF-κΒ和IL-1αmRNA水平也顯著升高（p<0.05）。薩佩羅病毒的增殖可以導致IPEC-J2細胞內(nèi)LOX-1、RIG-I和STAT2基因的mRNA水平顯著上調(diào)（p<0.01）。功能蛋白LOX-1、STAT2和RIG-I的表達呈現(xiàn)為漸進性變化。STAT2和LOX-1隨著病毒的感染和復制呈上調(diào)

10、趨勢，RIG-I蛋白的表達卻呈現(xiàn)為下調(diào)。
　　5.捷申病毒感染對IPEC-J2細胞機制的影響
　　捷申病毒導致的IPEC-J2細胞漸進性變化與薩佩羅病毒類似，但也呈現(xiàn)出明顯差異。捷申病毒的致細胞病變效應要弱于薩佩羅病毒，引起的細胞凋亡變化過程、細胞周期阻礙效應和細胞骨架重組過程也相應變慢。捷申病毒復制過程中活性氧水平的升高呈現(xiàn)為先逐漸升高，再下降，之后又迅速提升。同時，捷申病毒引起的細胞內(nèi)炎癥細胞因子和功能基因的轉錄變化要顯

11、著弱于薩佩羅病毒，但是功能基因LOX-1，STAT2和RIG-I的蛋白表達水平要高于薩佩羅病毒。
　　6. LOX-1過表達對IPEC-J2細胞機制的影響
　　通過研究LOX-1在IPEC-J2細胞中的功能，我們發(fā)現(xiàn)LOX-1在IPEC-J2細胞中的過表達可以誘導細胞的壞死，導致細胞骨架的重組，阻礙細胞周期的變化，促進細胞內(nèi)NO的生成和活性氧水平的升高。在LOX-1過表達細胞中，炎癥相關細胞因子IFN-α，TNF-α，IL-

12、1α和TGF-β的轉錄水平提高，功能基因RIG-I和STAT2的轉錄和蛋白表達被上調(diào)。將腸道病毒薩佩羅病毒和捷申病毒接種至LOX-1過表達細胞中或?qū)OX-1與環(huán)曲病毒蛋白酶基因共表達，病毒的增殖數(shù)量提高，蛋白酶的轉錄水平也顯著升高。
　　綜上所述，環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒和捷申病毒在豬腸道細胞IPEC-J2中復制時，可以提升細胞內(nèi)氧化應激水平，導致細胞凋亡，誘導細胞骨架重組，阻礙細胞周期變化，同時提高細胞內(nèi)炎癥相關細胞因子和功能基因

13、 LOX-1，STAT2和RIG-I的轉錄水平。不同種屬的腸道病毒對IPEC-J2細胞機制的影響呈現(xiàn)一定相似性，也存在著一些差異性。這種相似性和差異性對于我們進一步研究不同腸道病毒的致宿主細胞病理發(fā)生發(fā)展過程具有重要的參考意義，同時也有利于我們進一步探索腸道病毒共感染在腸道上皮細胞機能變化中的聯(lián)合作用或頡抗作用。LOX-1基因在 IPEC-J2細胞中過表達時，可以引起類似病毒感染的細胞機能變化，并且明顯促進環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒和捷申病毒