人巨細(xì)胞病毒感染樹突狀細(xì)胞后對(duì)其功能影響及機(jī)制研究.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒(hmancytomegalovirus，HCMV)屬β皰疹家族，在人群中感染非常普遍。正常人機(jī)體內(nèi)，HCMV處于一種潛伏的狀態(tài)，但在免疫功能受損患者(如器官移植、惡性腫瘤、AIDS病)體內(nèi)，HCMV可被激活，進(jìn)而引起一系列的臨床癥狀。目前，HCMV在體內(nèi)的活化或潛伏細(xì)胞尚不十分明確。 樹突狀細(xì)胞(DC)是免疫系統(tǒng)強(qiáng)有力的抗原遞呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵的引導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用，其成熟程度、亞群分類決定著免疫激活與免疫耐受之

2、間的平衡，DC的成熟程度為引發(fā)T淋巴細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答必需的條件之一。 有研究發(fā)現(xiàn)HCMV能夠感染多種類型的細(xì)胞，如表皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞以及單核/巨噬細(xì)胞等。HCMV能否感染單核細(xì)胞來源的DC并影響其功能，從而有助于其潛伏在宿主細(xì)胞內(nèi)，將是本研究的主要內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)共分三部分：一、HCMV能否感染DC。二、觀察受染DC功能變化，包括抗原吞噬能力、膜表面免疫應(yīng)答相關(guān)分子以及刺激同種異基因淋巴細(xì)胞增殖能力。三、初步探討HCMV

3、引起受染細(xì)胞上述變化的分子機(jī)制。 第一部分研究中，普通光鏡及透射電鏡的結(jié)果顯示，利用rhGM-CSF、rhIL-4、LPS組合在體外可誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞為DC，獲得的未成熟DC細(xì)胞膜表面突起相對(duì)較短，胞質(zhì)中細(xì)胞器較少；而成熟DC細(xì)胞膜表面有大量皺褶和突起，胞內(nèi)線粒體豐富，溶酶體少量，胞核大、不規(guī)則。 應(yīng)用一定滴度(50TCID50)的HCMV感染DC，檢測(cè)HCMV對(duì)DC細(xì)胞的感染效率。透射電鏡觀察，在HCMV處理的DC

4、胞核及胞漿內(nèi)均見到成熟的人類皰疹病毒樣顆粒；作用12h后，經(jīng)RT-PCR證實(shí)IE/GAPDH的比值在成熟DC和未成熟DC分別為0.102±0.020和0.862±0.124；經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)，HCMV感染24h后，EA陽(yáng)性率在未成熟DC組高于在成熟DC組，分別為(62.32±14.20)％和(10.78±3.04)％(P＜0.05)；受染細(xì)胞內(nèi)pp65抗原呈低表達(dá)，在未成熟DC，pp65抗原陽(yáng)性表達(dá)率為(4.24±0.38)％，在

5、成熟DC其表達(dá)率為(0.82±0.13)％。 實(shí)驗(yàn)初步揭示HCMV能夠有效感染未成熟DC。在第二部分作者進(jìn)一步觀察了受染細(xì)胞的功能的變化。1以流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC膜表面HLA-ABC、HLA-DR、CD80、CD86、CD83的表達(dá)，結(jié)果表明：HCMV感染DC的免疫表型發(fā)生變化，受染的未成熟DC經(jīng)分化誘導(dǎo)因子作用后HLA-ABC及HLA-DR表達(dá)率分別為(46.4±5.0)％、(54.3±5.7)％，均低于正常對(duì)照組的成熟階段DC

6、，后者分別為(92.0±3.9)％、(91.8±5.3)％，CD83明顯下調(diào)，其表達(dá)水平與未成熟階段的DC相當(dāng)，為(30.2±7.4)％，CD80、CD86略有升高，分別為(73.8±7.4)％、(77.8±8.9)％，但與未處理組相比無顯著性差異(P＞0.05)。2平均熒光強(qiáng)度(MFI)顯示HCMV感染后的未成熟DC攝取FITC-Dextran能力下降，約為未處理組的30-40％。3與未處理成熟的DC相比，HCMV感染的DC即使經(jīng)成熟

7、分化誘導(dǎo)因子LPS作用后，刺激異基因T細(xì)胞增殖能力較弱(P值均＜0.05)，其功能類似未成熟DC；而對(duì)HCMV感染的成熟DC來說，僅當(dāng)DC與T細(xì)胞比值為1∶1時(shí)，其向異基因淋巴細(xì)胞的刺激能力下降(P＜0.05)。 第三部分實(shí)驗(yàn)從肌動(dòng)蛋白出發(fā)以探討HCMV引起受染DC多種變化的可能分子機(jī)制。為驗(yàn)證肌動(dòng)蛋白骨架對(duì)DC功能的影響，以LatB(0.1μg/ml)及CytoD(2μg/ml)分別作用DC，發(fā)現(xiàn)處理后的DC成熟障礙，表現(xiàn)為H

8、LA-ABC、CD80、CD86、CD83表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，HLA-DR無顯著性改變。 肌動(dòng)蛋白聚集抑制劑LatB(0.1μg/ml)作用未成熟DC后，在不同時(shí)間(20min，40min，60min，80min)MFI分別為65.4±10.2、66.4±5.7、63.2±12.6、70.5±8.9，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DC吞噬抗原的能力并未發(fā)生明顯改變，其強(qiáng)度均低于未處理組(P值均＜0.05)。CytoD的作用結(jié)果與之相類似

9、。最終導(dǎo)致受處理的DC對(duì)Brdu的摻入量減少，刺激淋巴細(xì)胞的增殖能力顯著地弱于未處理組(P值均＜0.05)。 將HCMVAD169病毒株感染人胚成纖維細(xì)胞株HF細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著病毒毒力的增加，細(xì)胞形態(tài)均由梭形逐漸膨脹、變粗、變圓，甚至從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來。熒光標(biāo)記微絲探針顯示受染細(xì)胞內(nèi)微絲排列紊亂，極性消失，且胞內(nèi)熒光探針強(qiáng)度減弱。 經(jīng)RT-PCR證實(shí)，未感染組β-actin/GAAPDH比值為2.302±0.427，HC

10、MV感染未成熟DC24h后，其比值為7.025±0.873，明顯增高(P＜0.05)；受染72h、96h后，則分別為1.528±0.204和0.432±0.080，均顯著性低于未感染組(P＜0.05)；胞內(nèi)β-actin蛋白質(zhì)水平在受染后24h、72h分別是未感染組的90.1％、73.8％，至細(xì)胞受染96h后則為34.2％，微管蛋白在各組之間無顯著性差異。HCMV感染的未成熟DC經(jīng)LPS及肌動(dòng)蛋白聚集誘導(dǎo)劑PMA(25nM)刺激后，HL

11、A-ABC及HLA-DR表達(dá)率較未加PMA組增加，受感染DC抗原攝取能力及向淋巴細(xì)胞遞呈抗原能力部分恢復(fù)，但仍低于正常對(duì)照的未成熟DC。這些結(jié)果提示，HCMV可通過肌動(dòng)蛋白微絲骨架途徑影響受染DC的免疫功能。 HCMV感染的DC免疫減弱，可能是通過其對(duì)DC細(xì)胞骨架微絲肌動(dòng)蛋白的影響，導(dǎo)致受染未成熟DC向成熟階段轉(zhuǎn)化障礙所致。提示，臨床上，尤其是造血干細(xì)胞移植過程發(fā)生DC成熟或其在宿主內(nèi)反復(fù)被活化、感染將可能不利于DC對(duì)殘留的腫瘤