磷酸類抗原刺激健康人與結(jié)核病人外周血γδT細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α細(xì)胞數(shù)量的比較.pdf

1、研究背景：結(jié)核分枝桿菌（ mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的結(jié)核病（tuberculosis, TB）仍是是目前嚴(yán)重危害人類健康的三大感染性疾病之一。如何快速、準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病，是結(jié)核病防治的關(guān)鍵。然而，目前對(duì)結(jié)核病診斷的免疫學(xué)指標(biāo)尚缺乏滿意的方法。臨床診斷結(jié)核病的傳統(tǒng)方法如結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)、痰抗酸桿菌涂片、痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)等均存在缺點(diǎn)。近年來(lái)，利用酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫試驗(yàn)(enzyme linked immu

2、nospot，ELISPOT)檢測(cè)結(jié)核菌特異抗原T淋巴細(xì)胞的方法，為結(jié)核病快速診斷開辟了一條新的思路。目前臨床中使用的檢測(cè)結(jié)核桿菌感染試劑盒(T-SPOT-TB)，通過ELISPOT技術(shù)，選用結(jié)核桿菌特異性抗原ESAT6和CFP10刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)，檢測(cè)其中能與抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)并分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞，以此判斷是否感染Mtb。但這種試劑盒不能

3、區(qū)分隱匿性Mtb感染者（以下簡(jiǎn)稱隱感者）與TB患者。目前缺乏鑒別MTB隱感者和活動(dòng)性TB免疫狀態(tài)的方法。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)唑來(lái)磷酸（zoledronate，ZOL）、帕米膦酸（pamidronate，PAM）、異戊烯焦磷酸鹽（isopentenyl pyrophosphate，IPP）等磷酸類抗原可體外優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增γδT細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室前期研究初步表明結(jié)核病患者γδT細(xì)胞受磷酸類抗原一羥基二甲基二烯基四雙磷酸銨鹽［( E)1-Hydroxy-2-

4、Methyl-but-2-enyl4-Diphosphate ammonium salt，HDMAPP］刺激后產(chǎn)生IFN-γ的比例顯著低于健康者及隱感者。
　　目的：用磷酸類抗原刺激健康人、隱感者和TB患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，比較γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的差異。以闡明健康人、隱感者和TB患者之間γδT細(xì)胞免疫功能的差異，為進(jìn)一步開發(fā)新的臨床結(jié)核病檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)磷酸類抗原刺激γδ

5、T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α
　　1.1采集3例健康人外周血，分離PBMC后，分別加入不同濃度的IPP、二甲基丙烯焦磷酸鹽（Dimethylallyl pyrophosphate，DMPP）、HDMAPP、ZOL，刺激培養(yǎng)14小時(shí)，再加莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后收集細(xì)胞。加熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行表面分子和胞內(nèi)染色，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)γδT細(xì)胞中表達(dá)IFN-γ和TNF-α的比例。
　　1.2采集健康人、隱感者和

6、TB患者的外周血，分離PBMC，用磷酸類抗原刺激培養(yǎng)14小時(shí)，再加莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后收集細(xì)胞。加熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行表面分子和胞內(nèi)染色，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各T細(xì)胞亞群產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的比例。
　　2. ELISPOT檢測(cè)健康人、隱感者和TB患者的外周血PBMC中產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)
　　運(yùn)用結(jié)核分支桿菌抗原特異性T細(xì)胞ELISPOT診斷試劑盒，從健康人人群中篩選出隱感者。采集健康人、隱感者和

7、TB患者的外周血，分離出PBMC并調(diào)整細(xì)胞濃度（細(xì)胞濃度250萬(wàn)/ml），按試劑盒設(shè)計(jì)每孔加入100μl細(xì)胞懸液，再加入磷酸類抗原（IPP、ZOL）刺激，將EISPOT培養(yǎng)板放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20小時(shí)，進(jìn)行顯色，最后用ELISPOT計(jì)數(shù)儀進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，計(jì)算每25萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ZOL誘導(dǎo)健康人和結(jié)核患者的γδT細(xì)胞擴(kuò)增情況
　　采集健康人和結(jié)核患者的外周血，分離PBMC，調(diào)整

8、細(xì)胞濃度（100-150萬(wàn)細(xì)胞/ml），加入ZOL刺激，用含10％血清的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)12天后，收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞占細(xì)胞的比例。比較健康人和結(jié)核患者在ZOL誘導(dǎo)前后γδT細(xì)胞占細(xì)胞的比例的變化。
　　結(jié)果:1、不同濃度磷酸類抗原刺激健康人PBMC，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的百分比。
　　1.1不同濃度ZOL（終濃度：10μmol/L、20μmol/L

9、、40μmol/L、80μmol/L）刺激健康人的PBMC，γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的百分比分別是6.88±0.37、7.38±0.17、10.59±0.36、9.66±1.04，產(chǎn)生TNF-α的百分比分別是12.18±1.02、13.81±0.002、17.69±0.39、16.48±0.58。
　　1.2不同濃度HDMAPP（終濃度：10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）刺激刺激健康人的PBM

10、C，γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的百分比分別是7.21±0.74、9.65±0.01、15.18±0.42、14.58±0.63，產(chǎn)生TNF-α百分比分別是15.36±2.88、18.35±1.30、26.46±2.64、24.08±0.08。
　　1.3不同濃度IPP（終濃度：5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）刺激健康人的PBMC，γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的百分比分別是1.48±1.90、1.75

11、±1.15、3.62±0.29、2.20±1.03，產(chǎn)生TNF-α的百分比分別是2.91±2.18、3.83±2.95、7.95±0.32、4.80±1.48。
　　1.4不同濃度DMPP（終濃度：2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）刺激刺激健康人的PBMC，γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的百分比分別是0.45±0.06、0.62±0.16,、0.86±0.03、1.23±0.26，產(chǎn)生TNF-α的百

12、分比分別是0.80±0.02、1.08±0.21、2.27±0.10、3.15±0.53。
　　2、用結(jié)核桿菌ELISOPT檢測(cè)試劑盒從健康人中篩選出6例隱感者。
　　3、用磷酸類抗原（ZOL、HDMAPP、IPP、DMPP）刺激健康人的PBMC20小時(shí)后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，γδT細(xì)胞、αβT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的百分比。各組中γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的百分比，要明顯高

13、于αβT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的百分比（p＜0.01）。而各組中αβT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的百分比進(jìn)行比較，無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　3.1 ZOL組中γδT細(xì)胞、αβT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ的百分比分別是8.83±2.51、0.02±0.03、0.01±0.03、0.02±0.03，產(chǎn)生TNF-α的百分比分

14、別是17.73±2.79、0.02±0.03、0.03±0.04、0.04±0.03。（p＜0.01）。
　　3.2 HDMAPP組中γδT細(xì)胞、αβT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ的百分比分別是13.46±4.84、0.004±0.009、0.005±0.012、0.03±0.04，產(chǎn)生TNF-α的百分比分別是23.95±5.17、0.01±0.02、0.01±0.03、0.07±0.05。（p＜0.01）

15、。
　　3.3 IPP組中γδT細(xì)胞、αβT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ的百分比分別是6.55±2.75、0.01±0.02、0.01±0.03、0.01±0.03，產(chǎn)生TNF-α的百分比分別是12.06±3.40、0.03±0.03、0.02±0.03、0.03±0.04。（p＜0.01）。
　　3.4 DMPP組中γδT細(xì)胞、αβT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ的百分比分別是

16、，產(chǎn)生IFN-γ的百分比分別是2.20±1.44、0.01±0.01、0.02±0.02、0.001±0.002，產(chǎn)生TNF-α的百分比分別是5.62±2.89、0.03±0.02、0.05±0.04、0.03±0.02。（p＜0.01）。
　　4、用磷酸類抗原（ZOL、IPP）刺激健康人、隱感者和TB患者PBMC后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的比例。TB患者的γδT細(xì)胞經(jīng)ZOL、IPP刺激后產(chǎn)生IFN

17、-γ和TNF-α的細(xì)胞比例要明顯少于健康人和隱感者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。
　　4.1 ZOL組中健康人、隱感者和TB患者PBMC中γδT細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ的百分比分別是8.83±2.51、9.70±1.94、2.71±1.51，產(chǎn)生 TNF-α的百分比分別是17.73±2.79、18.86±1.77、6.09±3.32。（p＜0.01）。
　　4.2 IPP組中健康人、隱感者和TB患者PBMC中γδT細(xì)胞中產(chǎn)

18、生IFN-γ的百分比分別是6.55±2.75、5.54±3.46、2.32±1.03，產(chǎn)生 TNF-α的百分比分別是12.06±3.40、9.60±3.02、4.54±1.70。（p＜0.01）。
　　5、用EISPOT檢測(cè)健康人、隱感者和TB患者PBMC經(jīng)磷酸類抗原（ZOL、IPP）刺激后產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量，其中ZOL組分別是707±253、663±193、139±69， IPP組分別是400±203、391±138、75

19、±46。TB患者的PBMC經(jīng)磷酸類抗原刺激后產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量要明顯少于健康人和隱感者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。
　　6、健康人和結(jié)核患者的PBMC用ZOL刺激后，培養(yǎng)增殖12天后，γδT細(xì)胞占細(xì)胞的百分比分別是90.50±2.72、14.30±8.52。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.用磷酸類抗原刺激健康人的PBMC后，主要是γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，而αβT細(xì)胞幾