胚胎干細(xì)胞中外源性IbeB靶蛋白的篩選及驗(yàn)證.pdf

1、目的：
　　 人們?cè)谘芯恐虏【c宿主細(xì)胞相互作用過程中,于致病菌中發(fā)現(xiàn)了一些效應(yīng)蛋白(protein effectors),它們被細(xì)菌分泌出來后,有些可被輸送到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,這些蛋白不僅參與細(xì)菌侵襲宿主細(xì)胞過程,而且影響宿主細(xì)胞的某些重要功能。例如,單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)外膜蛋白InlB,通過肝細(xì)胞生長因子受體(Hepatocyte growth factor rec

2、eptor,HGF-R orMet)影響肝再生；李斯特菌溶血素能夠使上皮細(xì)胞內(nèi)的組蛋白H3S10去磷酸化；志賀氏菌通過細(xì)菌Ⅲ型分泌直接將其效應(yīng)蛋白OspF注射到上皮細(xì)胞的細(xì)胞核,通過阻止組蛋白H3的磷酸化而使NF-kB啟動(dòng)子部位的染色質(zhì)重塑。這些出乎意料的結(jié)果為認(rèn)識(shí)真核細(xì)胞生物學(xué)特性提供了新線索,從某種意義上說致病菌蛋白可作為研究真核細(xì)胞生物學(xué)功能的有力工具。ibeB基因是大腸桿菌K1株侵襲人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因,其成熟蛋白剪切方式

3、類似革蘭氏陰性細(xì)菌Ⅳ型分泌蛋白。本實(shí)驗(yàn)室將ibeB基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞,希望探索其對(duì)真核細(xì)胞生命活動(dòng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)轉(zhuǎn)染ibeB基因的HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性的神經(jīng)樣改變；(2)經(jīng)ibeB基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ES cell)AB2.1具有向神經(jīng)前體細(xì)胞分化的潛能。
　　 本課題旨在篩選胚胎干細(xì)胞中外源性IbeB的靶蛋白,希望闡明IbeB調(diào)控胚胎干細(xì)胞向

4、神經(jīng)前體細(xì)胞分化機(jī)制,為研究神經(jīng)分化的調(diào)控機(jī)制積累資料。
　　 方法
　　 1、酵母雙雜交法篩選IbeB相互作用蛋白。
　　 2、在酵母菌中驗(yàn)證IbeB與CathepsinA相互作用。
　　 3、在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)GST-IbeB融合蛋白表達(dá)并利用親和層析純化。
　　 4、利用GST-pull down實(shí)驗(yàn)體外驗(yàn)證IbeB與Cathepsin A相互作用。
　　 5、Western

5、blot和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Cathepsin A在小鼠腦發(fā)育過程中的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1、酵母雙雜交方法篩選出胚胎干細(xì)胞中外源性蛋IbeB的相互作用蛋白Cathepsin A。
　　 2、小量酵母雙雜交方法驗(yàn)證IbeB與Cathepsin A相互作用。
　　 3、GST-pull down方法證實(shí)IbeB與Cathepsin A相互作用。
　　 4、Cathepsin A在小鼠腦內(nèi)的表