胚胎干細胞中外源性IbeB靶蛋白的篩選及驗證.pdf

1、目的：
　　 人們在研究致病菌與宿主細胞相互作用過程中,于致病菌中發(fā)現(xiàn)了一些效應蛋白(protein effectors),它們被細菌分泌出來后,有些可被輸送到宿主細胞的細胞質和細胞核中,這些蛋白不僅參與細菌侵襲宿主細胞過程,而且影響宿主細胞的某些重要功能。例如,單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)外膜蛋白InlB,通過肝細胞生長因子受體(Hepatocyte growth factor rec

2、eptor,HGF-R orMet)影響肝再生；李斯特菌溶血素能夠使上皮細胞內的組蛋白H3S10去磷酸化；志賀氏菌通過細菌Ⅲ型分泌直接將其效應蛋白OspF注射到上皮細胞的細胞核,通過阻止組蛋白H3的磷酸化而使NF-kB啟動子部位的染色質重塑。這些出乎意料的結果為認識真核細胞生物學特性提供了新線索,從某種意義上說致病菌蛋白可作為研究真核細胞生物學功能的有力工具。ibeB基因是大腸桿菌K1株侵襲人腦微血管內皮細胞相關基因,其成熟蛋白剪切方式

3、類似革蘭氏陰性細菌Ⅳ型分泌蛋白。本實驗室將ibeB基因轉染真核細胞,希望探索其對真核細胞生命活動的影響,結果發(fā)現(xiàn):(1)轉染ibeB基因的HeLa細胞呈現(xiàn)膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性的神經(jīng)樣改變；(2)經(jīng)ibeB基因穩(wěn)定轉染的小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell,ES cell)AB2.1具有向神經(jīng)前體細胞分化的潛能。
　　 本課題旨在篩選胚胎干細胞中外源性IbeB的靶蛋白,希望闡明IbeB調控胚胎干細胞向

4、神經(jīng)前體細胞分化機制,為研究神經(jīng)分化的調控機制積累資料。
　　 方法
　　 1、酵母雙雜交法篩選IbeB相互作用蛋白。
　　 2、在酵母菌中驗證IbeB與CathepsinA相互作用。
　　 3、在大腸桿菌BL21中誘導GST-IbeB融合蛋白表達并利用親和層析純化。
　　 4、利用GST-pull down實驗體外驗證IbeB與Cathepsin A相互作用。
　　 5、Western

5、blot和免疫組織化學方法檢測Cathepsin A在小鼠腦發(fā)育過程中的表達。
　　 結果
　　 1、酵母雙雜交方法篩選出胚胎干細胞中外源性蛋IbeB的相互作用蛋白Cathepsin A。
　　 2、小量酵母雙雜交方法驗證IbeB與Cathepsin A相互作用。
　　 3、GST-pull down方法證實IbeB與Cathepsin A相互作用。
　　 4、Cathepsin A在小鼠腦內的表