胚胎干細胞中肝干細胞的篩選及在治療性肝再生中的應用.pdf

1、第一部分體外誘導E14小鼠ESC分化為肝細胞的研究.目的:基于肝臟發(fā)育生物學進展,建立有效誘導胚胎干細胞(ESC)向肝細胞分化的體外培養(yǎng)體系.方法:小鼠ESC細胞系E14,在內含1000U/ml的rmLIF的無飼養(yǎng)層高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),去除rmLIF后用懸滴培養(yǎng)法制備成擬胚體.依次加入10<'-7>M的Dexamethasone、10ug/L的FGF-4、25ug/L的HGF等誘導因子,繼續(xù)培養(yǎng)1-2周.然后取分化細胞,行細胞形態(tài)

2、學觀察、免疫細胞化學染色檢測白蛋白和CK8/18的表達、RT-PCR檢測白蛋白和轉甲狀腺蛋白等肝細胞特征性蛋白的mRNA轉錄水平.糖原染色、尿素合成功能檢測則對其功能進行檢驗.結論:1.加入FGF-4、HGF和Dex等肝臟胚胎發(fā)育時期的關鍵性調控因子的體外培養(yǎng)體系可以誘導胚胎干細胞分化為肝細胞樣細胞.2.發(fā)育生物學在ESC定向誘導分化研究中有一定的指導意義.第二部分淤膽血清"病理微環(huán)境"下ESC中肝干細胞的篩選.目的:探討淤膽血清"病理

3、微環(huán)境"培養(yǎng)體系誘導胚胎干細胞(ESC)向肝細胞分化的效果及對肝干細胞的篩選作用.方法:將小鼠ESC細胞系E14在無白血病抑制因子培養(yǎng)基中培養(yǎng),使其自發(fā)分化為擬胚體,加入FGF-4和HGF初步誘導,然后置于5％淤膽鼠血清"病理微環(huán)境"篩選培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2周,然后進行細胞形態(tài)學觀察,白蛋白和CK8/18免疫熒光染色,電鏡檢查和吲哚氰綠(ICG)攝取試驗.結論:采用含淤膽血清的"病理微環(huán)境"培養(yǎng)體系從經(jīng)FGF-4和HGF初步誘導的胚胎干細

4、胞中有效篩選出了具有功能的肝細胞樣細胞,細胞有較好的均質性,為臨床肝細胞替代治療的獲取豐富供體細胞來源提供了新思路.第三部分ESC源性肝干細胞在治療性肝再生中的應用.目的:應用治療性肝再生模型進行ESC源性肝干細胞肝內移植,觀察其在肝組織替代、體內的生長分化及成瘤性等情況,為ESC移植在難治性肝病治療中的臨床應用提供實驗依據(jù).方法:倒千里光堿+70%肝部分切除建立BALB/c小鼠的治療性肝再生模型.用熒光示蹤劑CFDA SE標記移植細胞

5、,將經(jīng)淤膽血清"病理微環(huán)境"篩選體系篩選出的ESC源性肝干細胞經(jīng)門靜脈移植入治療性肝再生模型小鼠肝內.然后熒光顯微鏡下觀察,檢測移植細胞體內分布、整合與肝細胞替代、體內生長分化等情況.2周后行白蛋白熒光免疫組化(雙熒光染色)、血清白蛋白水平檢測其功能狀況.并通過觀察其體內成瘤性對篩選出的ESC源性肝干細胞的安全性進行評估.結論:經(jīng)淤膽血清"病理微環(huán)境"篩選體系篩選出的ESC源性肝干細胞移植入治療性肝再生模型鼠肝內后可有效整合入宿主肝板、