Ⅰ、小檗堿上調(diào)肝臟低密度脂蛋白受體mRNA表達(dá)的信號(hào)通路研究Ⅱ、小檗堿類(lèi)似物Y53在糖尿病小鼠體內(nèi)抗炎、抗氧化和預(yù)防糖尿病腎病的作用研究.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 小檗堿上調(diào)肝臟低密度脂蛋白受體mRNA表達(dá)的信號(hào)通路研究
　　我們此前的研究結(jié)果顯示天然產(chǎn)物小檗堿(BBR)通過(guò)激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑來(lái)上調(diào)肝臟低密度脂蛋白受體(LDLR)的mRNA表達(dá)從而發(fā)揮降低血清膽固醇(CHO)的作用。但BBR是如何激活ERK的尚不明確。本研究旨在探索BBR激活ERK絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑的上游細(xì)胞信號(hào)通路和信號(hào)分子的作用機(jī)制。我們

2、在信號(hào)通路的阻斷實(shí)驗(yàn)中使用了多種化學(xué)抑制劑，如Raf-1特異性抑制劑GW5074、Ras抑制劑手霉素A(manumycinA)、蛋白激酶C(PKC)抑制劑十字孢堿和AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)特異性抑制劑compound C等，也用到了特異性的小干擾RNA(siRNAs)來(lái)沉默AMPK的表達(dá);應(yīng)用western blot來(lái)檢測(cè)相關(guān)蛋白激酶的磷酸化水平;采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)來(lái)檢測(cè)LDLRmRNA的表達(dá)水平;以

3、脂肪乳劑灌胃的方法建立了大鼠高血脂模型以研究BBR在體內(nèi)對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)BBR在HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中均可以顯著增加Raf-1的絲氨酸388(ser338)的磷酸化水平，這種作用具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性。BBR對(duì)Ras蛋白的活性沒(méi)有影響;其激活Raf-1信號(hào)通路和上調(diào)LDLRmRNA表達(dá)的作用能被GW5074所完全阻斷，但不能被manumycinA所阻斷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)BBR在高血脂模型的大鼠體內(nèi)

4、具有激活肝臟Raf-1和上調(diào)肝臟LDLR mRNA表達(dá)的作用，但不影響肝臟的Ras活性。更為重要的是，我們的研究結(jié)果顯示BBR激活Raf-1信號(hào)通路和上調(diào)LDLR mRNA表達(dá)的作用能夠被compound C這一特異性的AMPK抑制劑所完全阻斷，同時(shí)也能被AMPK siRNA所阻斷。綜上所述，我們的結(jié)果首次證明BBR在肝細(xì)胞中通過(guò)AMPK依賴的方式來(lái)激活Raf-1通路從而上調(diào)肝臟LDLR mRNA的表達(dá)，該過(guò)程與Ras途徑無(wú)關(guān)。我們的研

5、究進(jìn)一步闡明了BBR降CHO的分子藥理機(jī)制，為其將來(lái)在臨床用于治療高CHO血癥提供了新的科學(xué)依據(jù)。
　　第二部分 小檗堿類(lèi)似物Y53在糖尿病小鼠體內(nèi)抗炎、抗氧化和預(yù)防糖尿病腎病的作用研究
　　本部分實(shí)驗(yàn)旨在探索化合物假小檗堿(Y53)這一小檗堿(BBR)類(lèi)似物在糖尿病(DM)小鼠中的抗炎、抗氧化和預(yù)防糖尿病腎病(DN)的作用。
　　首先，我們觀察了Y53和BBR對(duì)正常小鼠血糖和肝、腎功能的影響。使用昆明(KM)小鼠，以

6、Y53100mg/kg或BBR100mg/kg灌胃給藥30天，觀察動(dòng)物的一般情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定空腹血糖(FBG)、肝功能指標(biāo)、腎功能指標(biāo)并進(jìn)行肝和腎的蘇木精&伊紅(H&E)染色，觀察病理學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Y53和BBR給藥后動(dòng)物一般情況良好，二者在100mg/kg這一劑量給藥時(shí)對(duì)KM小鼠的FBG、體重和肝、腎功指標(biāo)均無(wú)明顯影響，病理結(jié)果也提示Y53和BBR對(duì)肝臟和腎臟無(wú)明顯毒性。
　　接下來(lái)，我們探索了Y53在合并脂肪肝的D

7、M模型小鼠體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激、抗炎和調(diào)節(jié)糖脂代謝的活性與機(jī)制。我們采用高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)聯(lián)合一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)120mg/kg的方法誘發(fā)C57BL/6J小鼠DM的發(fā)生。此后，造模成功的DM模型小鼠被分為4組，分別每天口服灌胃給予生理鹽水、BBR50mg/kg、Y5350mgkg或是BBR100mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Y53能夠顯著降低DM小鼠的血脂和FBG，恢復(fù)血清胰島素水平和胰腺重量，并顯著上調(diào)肝臟低密度脂蛋白受體

8、(LDLR)和胰島素受體(InsR)的表達(dá)。Y53也能夠顯著抑制模型動(dòng)物肝臟脂肪變性，減少肝臟脂質(zhì)積聚，降低肝重和肝指數(shù)，恢復(fù)肝功能。DM模型組小鼠體內(nèi)存在著明顯的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。Y53可顯著上調(diào)DM動(dòng)物血清、肝臟和胰腺組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活性并降低丙二醛(MDA)的水平;另一方面，Y53顯著降低肝臟和胰腺組織中促炎性細(xì)胞因子如白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α) mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)增加核因子E2

9、相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化還原酶-1(NQO-1) mRNA的表達(dá)水平。Y53在DM小鼠體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激、抗炎和調(diào)節(jié)糖脂代謝的藥效優(yōu)于同劑量的BBR，幾乎與兩倍劑量的BBR藥效相當(dāng)。
　　在另一批動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們研究了Y53對(duì)小鼠DN的預(yù)防作用。我們采用一次性腹腔注射STZ120mg/kg的方法誘發(fā)C57BL/6J小鼠的DM模型。之后，DM模型動(dòng)物被分為4組，每天分別灌胃給予生理鹽水、BBR50m

10、g/kg、Y5350mg/kg或羅格列酮(ROSI)5mg/kg。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中和結(jié)束后，收集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尿液、全血、血清和腎臟組織，使用試劑盒檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。部分小鼠腎臟用于H&E染色，還使用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-PCR(qRT-PCR)的方式檢測(cè)腎臟中目的基因的mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Y53能夠顯著降低DM動(dòng)物的FBG和糖化血紅蛋白(GHb)，改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多食和多尿等DM癥狀。Y53還可以顯著降低血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)

11、、24 h尿蛋白、腎指數(shù)、血清和腎臟組織的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、一氧化氮(NO)、腎臟MDA、膽固醇(CHO)和甘油三酯(TG)含量，并顯著增加腎臟組織SOD的活力。在病理檢測(cè)中，Y53可明顯改善DM小鼠腎臟組織的形態(tài)學(xué)并抑制腎小球硬化。Y53能夠顯著降低DM小鼠腎臟中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平以及與腎臟纖維化病變相關(guān)的基因，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和smad2的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)中Y53的腎臟保護(hù)藥效明顯強(qiáng)于BBR和RO