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文檔簡介
1、從本實驗室構建的家蠶蛹cDNA文庫中篩選到一條cDNA序列,該序列為首次報道,GenBank登錄號為DN985186.1,由4個外顯子和3個內(nèi)含子構成。該序列長度為101.bp,ORF長67.bp,編碼224個氨基酸殘基,編碼的蛋白的N-端富含半胱氨酸,所以把它命名為BmCRP(Bomby.mor.cys-ric.protein),生物信息學預測其分子量24.9.kD,預測等電點為5.12。將BmCRP與數(shù)據(jù)庫中的蛋白進行比對,發(fā)現(xiàn)該蛋
2、白僅與昆蟲果蠅中的一些假想蛋白具有一些同源性(最高的同源性為31%),而在其他種屬中同源性較低。
通過PCR擴增BmCRP的ORF,純化產(chǎn)物經(jīng)BamHI和Xh.I雙酶切后插入到pET-28a(+)的Bam.I和Xh.I位點,篩選獲得重組表達質粒pET-28a(+)-BmCRP,經(jīng)PCR、雙酶切鑒定以及測序分析證實重組正確,篩選陽性克隆,轉化大腸桿菌BL21(DE3)。工程菌經(jīng).mM的IPTG誘導后,收集菌體并裂解,作SDS
3、-PAGE分析,結果在2.kD處有一濃集目的蛋白條帶,與預期值相符。融合蛋白以不溶性的包涵體的形式存在,超聲波裂解菌體分離包涵體并離心、洗滌;對包涵體進行溶解和梯度透析復性;采用親和層析純化融合蛋白rBmCRP。以該融合蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔,制備了rBmCRP多克隆抗體,ELISA檢測該抗體的效價可達到1:6400。免疫印跡檢測顯示該抗體對rBmCRP具有較好的特異性。免疫印跡檢測結果還表明,BmCRP在家蠶五齡幼蟲的頭部、表皮、
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