家蠶轉(zhuǎn)膠蛋白基因的原核表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、轉(zhuǎn)膠蛋白(transgelin),作為一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,在成體脊椎動(dòng)物的平滑肌組織中含量豐富。轉(zhuǎn)膠蛋白的表達(dá)是平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells,SMC)早期分化的標(biāo)志。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)膠蛋白的研究多數(shù)集中在脊椎動(dòng)物上,而對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物的研究較少。本研究從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到家蠶轉(zhuǎn)膠蛋白(Bm7TGN)的cDNA序列。該基因ORF長(zhǎng)為567 bp,編碼188個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子量為20.89 kD。同源性比較表

2、明該基因編碼的氨基酸序列與蜜蜂同源性為86.7％。
　　 將BmTGN基因的ORF克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上,得到重組質(zhì)粒pET-28a(+)-BmTGN。將該重組子轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,裂解菌體作SDS-PAGE分析,與陰性對(duì)照相比在25 kD左右的位置有一條特異性蛋白條帶。以親和層析的方法純化上清液,獲得目的蛋白His-BmTGN。目的蛋白經(jīng)FPLC反相柱層析進(jìn)一步純

3、化后,進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示該融合蛋白的分子量為24.589 kD,與理論值24.45 kD相符,從而證實(shí)了該蛋白表達(dá)的正確性。
　　 將純化的融合蛋白免疫新西蘭兔獲得多克隆抗體,ELISA檢測(cè)該抗體血清的效價(jià)可達(dá)1:6400以上。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,對(duì)BmTGN在家蠶不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中的mRNA的量進(jìn)行比較,并采用Western blotting方法對(duì)BmTGN蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,該蛋白在蠶蛹中表達(dá)量