家蠶Bm040825基因的表達及其功能初步研究.pdf

1、從本實驗室構建的家蠶蛹cDNA文庫中篩選得到一條新的cDNA，經NCBI比對分析后初步確定其為一未知基因，命名為家蠶Bm040825(Bombyxmori040825)，GenBank登陸號為DN236938。家蠶Bm040825基因cDNA長為869bp，開放閱讀框大小為489bp，采用DNrAStar軟件進行預測發(fā)現該基因編碼162個氨基酸殘基，預測分子量大小為19.4kD，等電點為9.58。從GenBank等數據庫中利用Blast

2、檢索，發(fā)現與Bombyxmori同源性較高的均為一些假設或預測蛋白，這些蛋白功能未知。將家蠶Bm040825的cDNA序列與家蠶基因組序列比對，結果表明該基因由一個外顯子組成。 我們根據cDNA序列的ORF框設計上下游引物，PCR擴增后經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，插入融合表達載體pET-28a(+)的相應酶切位點，成功構建重組融合蛋白表達質粒并轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經PCR、酶切鑒定以及測序分析證實重組正確

3、。IPTG誘導后裂解菌作SDS-PAGE分析，在23kD處有一濃集特異性蛋白條帶，與預期值相符。重組蛋白以可溶的形式表達，通過親和層析純化了重組蛋白，并使用該重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，ELISA檢測效價大于1:6400。以家蠶Bm5細胞進行免疫細胞化學實驗，結果顯示，在未分裂細胞中，Bm040825蛋白在細胞核與細胞質當中均有分布，而對于處在分裂期的細胞，Bm040825蛋白主要分布在細胞質中，在細胞核內幾乎不存在。構建綠