PI3K-AKT信號(hào)通路在骨結(jié)核發(fā)病中骨破壞機(jī)制的研究.pdf

1、目的：在體外模擬骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病過程中的骨破壞機(jī)制，探討骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病過程中 P13K/AKT信號(hào)通路在骨破壞中的作用機(jī)制。試圖通過實(shí)驗(yàn)研究闡明骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病環(huán)節(jié)中P13K/AKT信號(hào)通路對(duì)于骨破壞機(jī)制的影響。為將來的診斷及治療提供新的參考。
　　方法:（1）采用不同濃度結(jié)核桿菌超聲裂解產(chǎn)物誘導(dǎo)RAW264.7破骨細(xì)胞培養(yǎng)，體外模擬骨關(guān)節(jié)結(jié)核的骨破壞機(jī)制，用TRAP染色法(抗酒石酸酸性磷酸酶染色法)染色并計(jì)數(shù)，觀察破骨細(xì)胞分化能力的

2、變化。(2)采用結(jié)核桿菌超聲裂解產(chǎn)物誘導(dǎo) RAW264.7培養(yǎng)破骨細(xì)胞，加入不同濃度的特異性阻斷劑LY294002(5uM，10uM，20uM)，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western-bolt)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)蛋白AKT,p-AKT的表達(dá)；并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色并計(jì)數(shù)，觀察破骨細(xì)胞分化能力的變化。
　　結(jié)果：（1）培養(yǎng)7d后鏡下均可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，結(jié)核桿菌超聲裂解產(chǎn)物作用于RAW264.7細(xì)胞可見大量單個(gè)長(zhǎng)梭或類圓形細(xì)胞，

3、隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，體積增大。細(xì)胞作TRAP染色，顯示有大量的TRAP陽性細(xì)胞形成。骨磨片可見吸收陷窩形成，證明結(jié)核桿菌超聲裂解產(chǎn)物能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞。（2）結(jié)核桿菌超聲裂解產(chǎn)物能作用RAW264.7細(xì)胞后P13K／Akt信號(hào)通路下游分子AKT及p-AKT表達(dá)顯著增加(P<0.05)。加入特異性抑制劑LY294002阻斷后，AKT、p-AKT出現(xiàn)了劑量依賴性降低(P<0.05)。該結(jié)果證實(shí) LY2

4、94002成功阻斷了 P13K／AKT信號(hào)通路，并抑制誘導(dǎo)結(jié)核桿菌超聲裂解產(chǎn)物誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，抑制骨吸收作用。
　　結(jié)論:（1）一定濃度范圍內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌超聲裂解物（MTUS）能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞（OC）分化成熟；（2）高濃度的結(jié)核分枝桿菌超聲裂解物（MTUS）可導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞直接死亡，無法誘導(dǎo)成為破骨細(xì)胞，考慮與細(xì)菌毒力過強(qiáng)所致；（3）在結(jié)核分枝桿菌超聲裂解物（MTUS）誘導(dǎo)