大鼠腦創(chuàng)傷后PI3K-Akt信號通路參與神經(jīng)細胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、目的:探討創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后PI3K/Akt信號通路參與神經(jīng)細胞凋亡的分子機制,為臨床上早期干預和治療尋找新靶點,開拓新思路。
　　 方法:采用Marmarou方法,用重450g、直徑18mm的銅棒從1.2m高度自由落下?lián)糁写笫箢^部,造成大鼠中度彌漫性創(chuàng)傷性腦損傷。
　　 實驗動物及分組:SPF級健康雄性SD大鼠210只,體重280±20g,隨機分成3組:假手術(shù)組(n=42)；創(chuàng)傷+DMSO對照組(n=84)；創(chuàng)傷

2、+LY294002干預組(n=84)。每組劃分為傷后1h、3h、6h、24h、48h、72h、168h共7個時相點。
　　 檢測指標及方法:①神經(jīng)功能損害評分；②HE染色鏡下觀察腦組織結(jié)構(gòu)及病理形態(tài)；③免疫組織化學方法檢測p-Akt、NF-kB、Bax的免疫反應性及組織細胞定位情況；④Western-blot法檢測p-Akt、NF-kB、Bax的蛋白表達量。
　　 另取30只大鼠經(jīng)過游泳訓練后,隨機分為假手術(shù)組,創(chuàng)傷+D

3、MSO對照組,創(chuàng)傷+LY294002干預組,每組10只,進行Morris水迷宮測試檢測大鼠傷后學習記憶功能。
　　 定量測定:免疫組化陽性細胞陽性度強弱用Image Proplus6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)定量分析測定,以積分光密度值(IOD/AREA)來表示；Western blot蛋白定量分析用Image J圖像處理軟件分析測定,以目標OD值與內(nèi)參OD值的比值來表示。
　　 統(tǒng)計學分析:實驗中所得數(shù)據(jù)均用(x)±s表

4、示,用SAS V8統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,以單側(cè)p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1生命體征變化大鼠打擊傷后均有尿失禁及肢體肌張力增高表現(xiàn)。60％傷后伴有一側(cè)或雙側(cè)瞳孔擴大,持續(xù)2—5分鐘恢復,50％存在后肢劇烈抽搐,40％存在輕度抽搐、擺尾,持續(xù)0.5-1分鐘。致傷后多數(shù)呈短暫去大腦狀態(tài)及呼吸抑制,無輔助呼吸條件下,致傷后1-4分鐘恢復。本實驗大鼠死亡率為8％。
　　 2形態(tài)學觀察結(jié)果

5、 HE染色光鏡結(jié)果顯示:假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常,無蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦室出血,血管管腔正常,管壁光滑,神經(jīng)細胞數(shù)量多,形態(tài)完整。創(chuàng)傷組大鼠腦組織可見不同程度的廣泛蛛網(wǎng)膜下腔出血或黃染,血管腔擴大,大腦皮層下廣泛組織水腫,毛細血管充血,血管壁增厚,血管腔塌陷,神經(jīng)細胞變性,大腦皮層與深部白質(zhì)交界區(qū)間隙增寬,組織間質(zhì)水腫、出血等改變。未見腦實質(zhì)內(nèi)出血及挫裂傷。LY294002干預組腦組織病理形態(tài)改變較DMSO對照組有不同程度加重(Fig.

6、6)。
　　 3神經(jīng)功能評分結(jié)果假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分為24分。與假手術(shù)組比較,創(chuàng)傷組大鼠在后肢抓持反射、觸須誘發(fā)前肢定位及側(cè)向墊步試驗中均表現(xiàn)異常,評分下降(p<0.05)。IN294002干預組與DMSO對照組比較,在48h、72h、168h神經(jīng)功能評分下降(p<0.05)(Fig.4-1,2；Tablel)。
　　 4 p-Akt免疫組化及Western blot檢測結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示:p-Akt陽性細胞形態(tài)不

7、規(guī)則,胞核固縮,陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒,主要定位于胞漿,少部分定位于胞核。假手術(shù)組偶見p-Akt陽性細胞,著色淺淡,免疫反應性不隨時間發(fā)生變化。在DMSO對照組p-Akt陽性細胞著色呈深棕黃色,在傷后6h表達顯著增加,隨時間推移陽性細胞逐漸增多,免疫反應性逐漸增強,24h表達達高峰,之后表達逐漸衰減,陽性產(chǎn)物持續(xù)表達至傷后168h仍高于假手術(shù)組。在LY294002干預組,p-Akt的表達時程與DMSO對照組相似,但各時相點免疫反應性明顯減

8、弱(p<0.05)。Westernblot檢測結(jié)果同免疫組化結(jié)果(Fig.1-1,2,3,4；Fig.7-1,2；Table3—1,2)。
　　 5.NF-kB免疫組化及Western blot檢測結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示:NF-kB陽性細胞的胞質(zhì)和/或胞核中彌漫棕黃色顆粒。假手術(shù)組NF-kB陽性產(chǎn)物微弱表達,細胞胞漿可見少量棕黃色顆粒,此時NF-kB以無活性的形式存在。DMSO對照組于傷后3h在胞漿和胞核即有陽性表達,此時出現(xiàn)明顯

9、NF-kB核轉(zhuǎn)位,并且陽性產(chǎn)物的表達隨時間呈上升趨勢,免疫反應性在24-48h達高峰,此時細胞質(zhì)和細胞核均可見到大量棕黃色顆粒,之后表達逐漸衰減,至傷后168h仍有表達且高于假手術(shù)組。LY294002干預組中,各時相點NF-kB的陽性表達均較DMSO對照組明顯減弱(p<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示:傷后1-168h,DMSO對照組及LY294002干預組中NF-kB的陽性表達高于假手術(shù)組(p<0.05),傷后3h胞漿

10、陽性產(chǎn)物表達明顯增強,在6h達高峰,之后開始下降,至168h陽性表達仍高于假手術(shù)組水平。此結(jié)果與免疫組化結(jié)果不符,我們認為出現(xiàn)此情況的因為是NF-kB在傷后3h出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位,在24-48h核轉(zhuǎn)位達高峰。傷后1h至168h,LY294002干預組中胞漿NF-kB陽性產(chǎn)物的表達低于DMSO對照組(p<0.05)(Fig.2-1,2,3,4；Fig.8-1,2；Table4—1,2)。
　　 6 Bax免疫組化及Weaern blot檢

11、測結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示:Bax陽性產(chǎn)物定位于胞漿,呈彌漫或散在的棕黃色顆粒。假手術(shù)組中Bax在大鼠腦皮質(zhì)極少量表達,且不隨時間變化。DMSO對照組中傷后6h Bax陽性細胞呈深棕黃色,陽性產(chǎn)物明顯增多,免疫反應性于48h-72h達高峰,168h表達下降但仍高于假手術(shù)組水平。LY294002干預組中Bax在傷后各時相點的表達較DMSO對照組增強(p<0.05)。Weaern blot檢測結(jié)果同免疫組化結(jié)果(Fig.3—1,2,3,4；Fi

12、g.9-1,2；Table5—1,2)
　　 7 Morris水迷宮結(jié)果創(chuàng)傷組大鼠在傷后第7-10天搜索安全島潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(p<0.05)。LX294002干預組大鼠在傷后第7—10天搜索安全島潛伏期較DMSO對照組明顯延長(p<0.05)。另外運動軌跡圖象分析顯示DMSO對照組大鼠在搜索策略上也較LY294002干預組更為理想(Fig.5-1,2；Fig.10-1,2,3；Table2)。
　　 結(jié)論: