龍葵和水母蛋白酶抑制劑基因在植物基因工程中的應(yīng)用研究.pdf

1、蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitor，PI)是對(duì)蛋白水解酶有抑制活性的一種小分子蛋白質(zhì)，在動(dòng)物、植物、微生物等中普遍存在。PI能與蛋白酶的活性部位和變構(gòu)部位結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合體，抑制酶的催化活性或阻止酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶，從而抑制了蛋白酶降解蛋白質(zhì)的能力，并在生物體內(nèi)與各種調(diào)控作用的蛋白酶形成一定的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命過(guò)程。蛋白酶抑制劑在植物對(duì)害蟲，病原體的侵染防御系統(tǒng)，及調(diào)節(jié)蛋白酶活性和蛋白質(zhì)代謝等

2、方面有著十分重要的作用及具有廣泛的應(yīng)用前景。 本論文以龍葵絲氨酸型蛋白酶抑制劑Ⅱa（Solanum americanum proteinase inhibitorⅡa，SaPIN2a)，龍葵絲氨酸型蛋白酶抑制劑Ⅱb（Solanum americanum proteinase inhibitorⅡb，SaPIN2b)和水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cystatin from jelly fish Cystatin J)三種蛋白酶抑制劑

3、為研究對(duì)象，通過(guò)植物基因工程的方法，研究了其在植物抗蟲、抗病毒、抗菌、保護(hù)外源蛋白等方面的功能及在農(nóng)業(yè)生物防治和植物細(xì)胞生物反應(yīng)器中的應(yīng)用，并取得以下結(jié)果： 1.本研究利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草，獲得超量表達(dá)SaPIN2a轉(zhuǎn)基因煙草，通過(guò)對(duì)SaPIN2a及SaPIN2b轉(zhuǎn)基因煙草做PCR，Northern blot及Western Blot檢測(cè)，證明了這兩種基因分別在轉(zhuǎn)基因煙草中超量表達(dá)。酶抑制活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋

4、白酶有較高的抑制作用，并且對(duì)棉鈴蟲和斜紋夜蛾的中腸類胰蛋白酶也有抑制作用。有趣的是，利用掃描電鏡還研究發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)SaPIN2a轉(zhuǎn)基因植株葉片上的毛狀體比對(duì)照組明顯增多，而氣孔的數(shù)量沒(méi)有增加，這表明蛋白酶抑制劑可能參與調(diào)控毛狀體的發(fā)育，同時(shí)增加的毛狀體也可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株葉片對(duì)外來(lái)蟲害的抵御能力。通過(guò)抗蟲實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)棉鈴蟲和斜紋夜蛾的生長(zhǎng)發(fā)育有抑制作用，提高了抗蟲能力，因此這兩種蛋白酶抑制劑基因可以用于抗蟲植物基因工程的研

5、究以及棉鈴蟲，斜紋夜蛾等鱗翅目昆蟲的生物防治。 2.本研究利用預(yù)測(cè)具有分泌功能的SaPIN2a信號(hào)肽和SaPIN2a cDNA構(gòu)建含潮霉素篩選基因的植物表達(dá)載體35S—2aSP—SaPIN2a，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草BY—2細(xì)胞，PCR鑒定到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株系，RT—PCR表明轉(zhuǎn)基因株系中SaPIN2a基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，western blot同樣檢測(cè)SaPIN2a在細(xì)胞培養(yǎng)基中的存在。意外的是，我們檢測(cè)到BY—2細(xì)胞中可能存在與Sa

6、PIN2a同源性較高的蛋白的存在，并且有很強(qiáng)的表達(dá)。培養(yǎng)基蛋白酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因BY—2細(xì)胞培養(yǎng)基中蛋白酶活性比對(duì)照株系要低，可能是分泌的SaPIN2a蛋白抑制了部分培養(yǎng)基中絲氨酸型蛋白酶的活性，因此可以在植物細(xì)胞生物反應(yīng)器中利用該表達(dá)系統(tǒng)來(lái)保護(hù)外源重組蛋白。本研究還從健康人血液中提取總RNA，利用RT—PCR法克隆全長(zhǎng)的HSA cDNA序列，構(gòu)建超量表達(dá)載體35S—HSA，同時(shí)構(gòu)建含有分泌功能的信號(hào)肽及HSA cDNA的植物表達(dá)載體

7、35S—SPp—HSA。以購(gòu)買的HSA蛋白作為抗原，免疫新西蘭兔，制作HSA多克隆抗體，以便后面的檢測(cè)之用。研究用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將35S—HSA的表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化煙草，BY—2和胡蘿卜懸浮細(xì)胞，經(jīng)含卡那霉素（Kan)的培養(yǎng)基篩選，獲得卡那抗性煙草，BY—2懸浮細(xì)胞和胡蘿卜細(xì)胞；同時(shí)將35S—SPp—HSA的表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化BY—2細(xì)胞。CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植物懸浮細(xì)胞基因組DNA做PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSA cDNA在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞基因組中整合。RT

8、—PCR也表明轉(zhuǎn)基因株系中HSA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)基因細(xì)胞總蛋白做western blot檢測(cè)證明35S—HSA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化株系檢測(cè)到微弱HSA蛋白的表達(dá)，并且有降解片段。而含有信號(hào)肽及HSA cDNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化株系檢測(cè)到HSA蛋白的表達(dá)，但是表達(dá)量不高。進(jìn)一步研究我們將蛋白酶抑制劑SaPIN2a和HSA通過(guò)共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)在BY—2細(xì)胞培養(yǎng)基中共表達(dá)，利用蛋白酶抑制劑降低培養(yǎng)基中蛋白酶的活性，保護(hù)重組

9、蛋白的表達(dá)，減少其在培養(yǎng)基中的降解，以期提高藥用蛋白HSA的表達(dá)量。目前的結(jié)果來(lái)看，共轉(zhuǎn)化蛋白酶抑制劑的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株系培養(yǎng)基中外源蛋白HSA表達(dá)量并沒(méi)有明顯提高，這可能與HSA的自身表達(dá)低有關(guān)，我們需要做進(jìn)一步的研究。 3.本研究利用農(nóng)桿菌侵染法分別將含有35S啟動(dòng)子及水稻RSs1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)雪花蓮凝集素表達(dá)的載體轉(zhuǎn)化煙草，獲得的轉(zhuǎn)基因植株，并與本實(shí)驗(yàn)室已有的含韌皮部特異表達(dá)的SaPIN2a啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GNA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草比較各個(gè)

10、轉(zhuǎn)基因株系的GNA蛋白表達(dá)。研究結(jié)果表明GNA基因已經(jīng)整合到植物細(xì)胞基因組中，RT—PCR顯示轉(zhuǎn)基因株系中GNA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但是western blot僅檢測(cè)到GNA在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的表達(dá)，而其他兩個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植株并未檢測(cè)到GNA的存在。這表明SaPIN2a啟動(dòng)子和水稻RSs1啟動(dòng)子在煙草植株中的表達(dá)活性比較弱或不能成功地驅(qū)動(dòng)GNA表達(dá)。 4.本研究通過(guò)在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cyst

11、atin J，并利用Talon金屬離子親和層析柱純化獲得Cystatin J高純度融合蛋白，活性測(cè)定表明Cystatin J具有對(duì)木瓜蛋白酶有抑制作用。研究將純化的Cystain J融合蛋白作為抗原，免疫新西蘭兔，獲得Cystatin J多克隆抗體。同時(shí)將純化的Cystain J融合蛋白用來(lái)做抗真菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Cystain J融合蛋白對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani)有抑制作用，而對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusariumo

12、xysporum)，炭疽菌（Anthrax)，哈茨木霉（Trichoerma harzianum)等都沒(méi)有抑制效果。進(jìn)一步通過(guò)在轉(zhuǎn)基因煙草中超量表達(dá)Cystatin J的研究，發(fā)現(xiàn)Cystatin J成功的整合到煙草基因組中，利用自制的Cystatin J多克隆抗體做Westen blot也檢測(cè)到Cystatin J蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的表達(dá)。提取轉(zhuǎn)基因植株葉片總蛋白，活性檢測(cè)表明轉(zhuǎn)基因煙草葉片可溶性總蛋白對(duì)木瓜蛋白酶同樣具有抑制作用