河北楊巰基蛋白酶抑制劑基因的分離和功能鑒定.pdf

1、基因控制技術(shù)是森林有害生物綜合治理(IPM)控制策略的核心技術(shù)之一，發(fā)現(xiàn)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的功能基因是實現(xiàn)這一技術(shù)的關(guān)鍵和基礎(chǔ)，巰基蛋白酶抑制劑(Cysteineproteinaseinhibtor，CPI)是一類廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)的一個超級族，由于CPI能夠有效地抑制昆蟲中腸的巰基蛋白酶的水解作用而達到殺蟲的目的，因此，巰基蛋白酶抑制劑已被廣泛地應(yīng)用于抗蟲基因工程中。天牛類害蟲作為我國林業(yè)上重大的森林有害生物，危害極其嚴重。天

2、牛屬于鞘翅目害蟲，主要利用消化道內(nèi)的巰基蛋白酶來進行消化，所以分離和克隆植物巰基蛋白酶抑制劑(Phytocystatins，PhyCys)基因并將其應(yīng)用到天牛的抗蟲基因工程中，將是一種有效的控制天牛措施。本研究選用我國抗天牛的鄉(xiāng)土樹種河北楊為研究對象，首次應(yīng)用RT-PCR方法從河北楊形成層中分離和克隆了CPI基因，通過真核表達載體的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達，獲得了經(jīng)親和層析和Western方法檢測的真核表達重組蛋白，在此基礎(chǔ)上對該基因進行了抗蟲性

3、的功能鑒定，主要研究結(jié)果如下： 1.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從河北楊形成層中分離和克隆了CPIcDNA編碼區(qū)段。序列分析表明該基因編碼區(qū)長為710bp，包括一個429bp完整的開放閱讀框，編碼143個氨基酸殘基，此序列具有典型的植物巰基蛋白酶抑制劑的保守序列。在此基礎(chǔ)上，為獲得更長的CPIcDNA，本研究應(yīng)用了RT-PCR的方法獲得了759bp的3’端河北楊CPIcDNA。 2.分析和預(yù)測了河北楊CPIcDNA基因所編碼的蛋

4、白質(zhì)的相關(guān)特性。表明河北楊CPI是一種酸性(pI6.51)的小分子量的多肽(15-20KDa)；親/疏水性、蛋白質(zhì)活性位點和保守區(qū)段、亞細胞定位、跨膜區(qū)域和結(jié)構(gòu)功能域分析表明：該基因所編碼的蛋白具有一個疏水性區(qū)域和信號肽區(qū)域(MISSSFISPLLTLAVVLTVTITPLISA)，具有典型的cystatins保守區(qū)段和蛋白質(zhì)活性位點(EQVVAGTMHHLTIE)，屬于一種細胞外蛋白并具有一個跨膜區(qū)域(LLTLAVVLAVTITPLI

5、SASGGFC)，蛋白結(jié)構(gòu)功能域分析表明，河北楊CPI也屬于一種單結(jié)構(gòu)域(GGVHDSQSSQNSAEIDSLARFAV)的小分子多肽。 3.應(yīng)用PCR方法獲得了795bp的河北楊CPI基因，其基因中包含一個內(nèi)含子和兩個外顯子，具有典型的GT/AG法則。其啟動子序列從上游第4個堿基-到第54個堿基，是一種來自于林木上的單結(jié)構(gòu)域的植物CPI，不能歸于Margis所進行的分類范疇，屬于一種新的植物CPI。 4.應(yīng)用CLUST

6、AL(1.83)軟件比對了河北楊與其它43種植物CPI的氨基酸序列同源性，結(jié)果表明，河北楊和大多數(shù)植物CPI具有相同的保守區(qū)域，說明了河北楊CPI在進化上比較保守；應(yīng)用MEGA3.1對上述植物CPI的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，植物CPI可以大致分為三大類群，其中第一類群包括絕大部分的植物CPI，第一類群并可繼續(xù)分為三個亞類，河北楊CPI主要屬于第一類型中的第一亞類，系統(tǒng)發(fā)育分析也說明，植物CPI在植物體內(nèi)表現(xiàn)出超家族和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特點。

7、5.構(gòu)建了帶BamHI和EcoRI酶切位點的河北楊CPI的真核表達質(zhì)粒pYEX4T-2，通過酵母菌的轉(zhuǎn)化和硫酸銅不同時間的誘導(dǎo)表達，親和層析后獲得了大約20KDa單一的重組蛋白，SDS-PAGE和Western方法檢測證明了重組蛋白就是河北楊CPI基因在真核表達載體中高效表達的特異性蛋白，這也是國內(nèi)首次通過真核表達載體的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達植物CPI的方法，為鑒定基因的功能提供了蛋白資源。 6.將上述獲得的重組蛋白與不同量的飼料混合，

8、通過對2-3齡松墨天牛室內(nèi)飼喂試驗研究表明：不同含量的重組蛋白對松墨天牛的生長發(fā)育影響不同。當飼料中重組蛋白的含量較低時(0.0125mg/g)時，松墨天牛的生長和發(fā)育受到明顯的抑制，當重組蛋白的含量越來越高時(0.025-0.2mg/g)，其殺蟲效果越好，松墨天牛死亡也越早(2d)，死亡率也越高(100％)；與此同時，天牛的活動能力與飼料中的重組蛋白的含量呈明顯的相關(guān)性，重組蛋白的濃度越高，天牛取食后活動能力越差；接近死亡時，天牛的形