擬南芥與鹽芥TOR的功能研究.pdf

1、TOR(target of rapamycin)是最先在酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的大型蛋白，它存在于大多數(shù)真核生物中。TOR在各種真核生物中都非常保守，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。研究發(fā)現(xiàn)，Rapamycin可以與 FKBP12結(jié)合形成RAPA-FKBP12復(fù)合體，該復(fù)合體可以與 TOR結(jié)合，封阻 TOR，使其處于非活性狀態(tài)，抑制 TOR通路的活性。TOR作為一種重要的調(diào)節(jié)基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞能量代謝等多種途徑發(fā)揮重要的生理

2、功能，在細(xì)胞的增殖、生長、分化過程中起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用。在酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，TOR的調(diào)節(jié)作用主要通過兩組TOR復(fù)合物完成，分別是:TORC1和TORC2.其中，TORC1對(duì)雷帕霉素敏感，主要調(diào)控由生長因子、能量、營養(yǎng)、逆境等引起的細(xì)胞生長方面的變化，如RNA翻譯、蛋白質(zhì)合成等；TORC2則對(duì)雷帕霉素不敏感，主要對(duì)形成細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白起調(diào)控作用。
　　植物的生長和發(fā)育具有很強(qiáng)的可塑性，其形態(tài)及器官會(huì)因環(huán)境的變化發(fā)生很大的變化

3、。因此，TOR在植物生長發(fā)育中所起的作用也越來越受到關(guān)注。在植物中研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥 TOR(AtTOR)的基因組序列長度為17555bp，cDNA序列長度為8007bp，蛋白序列含2481個(gè)氨基酸，分子量為279kDa。擬南芥 TOR突變體純合子無法完成生活史，由此可見，植物中的TOR對(duì)植物的生長發(fā)育同樣起著舉足輕重的作用，有可能是通過調(diào)控蛋白質(zhì)的合成而間接地調(diào)控了生長發(fā)育。
　　與酵母及哺乳動(dòng)物不同的是，AtTOR對(duì)雷帕霉素不敏

4、感，主要是因?yàn)锳tFKBP12無法與雷帕霉素形成二聚體，也就無法與 AtTOR的FRB域相互作用。但是玉米的TOR蛋白(ZmTOR)對(duì)雷帕霉素是敏感的，這可能與各個(gè)物種間 FKBP12蛋白的氨基酸組成有關(guān)。
　　在擬南芥中只有一組AtTOR蛋白復(fù)合體，參與了植物生長的調(diào)控。AtRaptor作為哺乳動(dòng)物Raptor的同源基因，能與 AtTOR結(jié)合組成AtTORC，調(diào)控下游作用因子。擬南芥中沒有與 Rictor(TORC2蛋白之一)同

5、源的基因。
　　作為近幾年新興的一種耐鹽模式植物，鹽芥在植物耐逆性，尤其是耐鹽性的研究中已經(jīng)廣泛應(yīng)用。鹽芥的耐逆性遠(yuǎn)強(qiáng)于擬南芥，但其生長周期也比擬南芥要長很多。本實(shí)驗(yàn)對(duì)AtTOR利用多個(gè)分子生物學(xué)手段進(jìn)行了研究，同時(shí)克隆了ThTOR基因，對(duì)ThTOR也進(jìn)行了一些初步研究。
　　主要結(jié)果如下:
　　1)分析 AtTOR的cDNA序列，從中選擇出特異性較強(qiáng)的兩段序列，分別位于AtTOR的5’端 HEAT domain區(qū)和3

6、’端激酶區(qū)，分別構(gòu)建 AtTOR-RNAi植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得擬南芥的AtTOR基因沉默株系。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行分子鑒定后，選擇 AtTOR表達(dá)量下調(diào)的株系用作表型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默株系的生長比野生型要緩慢，而且用5’端片段進(jìn)行基因沉默的植株，還有敗育，及苔叢生等特點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因株系的愈傷組織的生長情況也不如野生型。
　　2)分析 AtTOR的啟動(dòng)子序列，PCR獲得全長序列。用PlantCARE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測，獲得的

7、啟動(dòng)子中除了啟動(dòng)子必須的TATA-box和GAAT-box，還含有7個(gè) ABA反應(yīng)元件ABRE、1個(gè)干旱響應(yīng)元件 DRE、熱響應(yīng)元件 HSE一個(gè)、以及許多與植物發(fā)育相關(guān)的元件。構(gòu)建不同長度的啟動(dòng)子-GUS融合表達(dá)載體，獲得轉(zhuǎn)基因植株后，進(jìn)行GUS染色，發(fā)現(xiàn)AtTOR特異地在胚軸、下胚軸與根部結(jié)合處以及葉原基處表達(dá)。但是不用長度的啟動(dòng)子定位和染色強(qiáng)弱有所不同。全長啟動(dòng)子-GUS沒有表達(dá)，而最短的644 bp啟動(dòng)子 GUS表達(dá)量相對(duì)較高，但

8、是定位特異性降低。由此分析，在整個(gè)啟動(dòng)子序列中，可能還存在未知的抑制因子或定位作用因子。
　　3)用軟件 TargetP1.1預(yù)測 AtTOR蛋白的亞細(xì)胞定位，預(yù)測結(jié)果是葉綠體。用DNAMAN軟件預(yù)測 AtTOR蛋白的跨膜區(qū)，預(yù)測 AtTOR有兩段跨膜區(qū)。選取可能存在信號(hào)肽的AtTOR蛋白的5’端和3’端序列，以及兩段跨膜區(qū)，構(gòu)建 AtTOR-GFP融合蛋白植物表達(dá)載體。用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因株系的根及葉的下表皮，根內(nèi)的GF

9、P表達(dá)均勻，無特異的定位信號(hào)；而地上部分的定位結(jié)果則顯示是葉綠體，與預(yù)測一致。但由于只是用了總蛋白其中的片段進(jìn)行定位，因此定位信號(hào)并不是準(zhǔn)確無誤的。必須通過進(jìn)一步的原位雜交和免疫組化實(shí)驗(yàn)，用抗體的特異結(jié)合，來確定 AtTOR真正的亞細(xì)胞定位。
　　4)不同的脅迫處理會(huì)使 AtTOR表達(dá)量發(fā)生變化，將處于營養(yǎng)生長旺盛期的擬南芥分別用150 mM NaCl、29.1 mM PEG6000、300 mM甘露醇、75μM ABA、37℃、

10、4℃分別處理0h、3h、6h、12h、24h、48h；用20μM醋酸鉛和20μM CuCl2分別處理12h、24h、48h；分別用0 mM、50 mM、100 mM、150 mM和200 mM的NaCl處理24h。由于AtTOR在擬南芥中本底水平表達(dá)量很低，用Northern雜交的方法無法檢測到 AtTOR的信號(hào)，因此，本實(shí)驗(yàn)以未處理的野生型擬南芥做對(duì)照，用Realtime-PCR的方法對(duì)AtTOR表達(dá)水平進(jìn)行分析。滲透、冷、熱、ABA

11、均能大幅度上調(diào) AtTOR的表達(dá)量。NaCl和重金屬則降低了AtTOR的表達(dá)量。
　　AtTOR在擬南芥各器官中的表達(dá)也有較大差異，以蓮座葉為對(duì)照，莖中最低，低于蓮座葉；在莖生葉中最高，其次是花和果莢，根和萌發(fā)10天的幼苗中的表達(dá)量也高于蓮座葉。
　　5)采用RT-PCR、3’-RACE和5’-RACE的方法從鹽芥中克隆獲得了ThTOR的cDNA。所獲得的ThTOR基因的cDNA全長7836 bp，開放讀碼框?yàn)?437 bp

12、，5’非編碼區(qū)為196 bp，3’非編碼區(qū)為203 bp，ThTOR編碼2479個(gè)氨基酸，分子量為279 kDa。分析發(fā)現(xiàn)，ThTOR的cDNA序列與 AtTOR的cDNA序列同源性約為95％，二者的蛋白序列同源性高達(dá)97。5％。ThTOR也具有TOR基本的結(jié)構(gòu)域:FAT域，1309-1887 Aa；FRB域，1920-2023 Aa；激酶域，2090-2340 Aa；FATC域，2447-2479 Aa。
　　根據(jù)獲得的ThTO

13、R基因 cDNA序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增 ThTOR的基因組序列。獲得的整個(gè) ThTOR基因組序列長度為19162 bp，其中含有55段內(nèi)含子和56段外顯子。
　　為了更好的研究ThTOR及AtTOR基因功能的差異，分析 ThTOR的基因組序列中的酶切位點(diǎn)，將 ThTOR的基因組分成7段分別克隆，測序檢測正確后，將7段序列連接成完整的ThTOR基因組，構(gòu)建 ThTOR基因組植物過量表達(dá)載體，擬轉(zhuǎn)化野生型擬南芥和AtTOR的沉默株系。

14、r>　　6)分析 ThTOR的cDNA序列，選擇 FAT域的一段特異區(qū)用來構(gòu)建 ThTOR基因沉默植物表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化鹽芥，獲得鹽芥的ThTOR基因沉默株系。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行分子鑒定后，選擇 ThTOR表達(dá)量下調(diào)的株系 ThI5和ThI6用作表型分析。鹽芥沉默株系的表型與擬南芥接近，生長比野生型要緩慢，種子也有敗育現(xiàn)象。
　　7)與擬南芥相同，用不同的脅迫條件處理鹽芥，ThTOR的表達(dá)量也會(huì)有變化。將處于營養(yǎng)生長旺盛期的鹽芥分

15、別用250 mM NaCl、34.9 mM PEG6000、500 mM甘露醇、75μM ABA、37℃、4℃分別處理0h、3h、6h、12h、24h、48h；用20μM醋酸鉛和20μM CuCl2分別處理12h、24h、48h；分別用0 mM、100 mM、200 mM、300 mM和400 mM的NaCl處理24h。用Realtime-PCR的方法鑒定 ThTOR基因表達(dá)情況。鹽、滲透、冷、熱、ABA、重金屬處理，均能引起 ThTO

16、R表達(dá)量的上調(diào)。
　　對(duì)鹽芥各器官中ThTOR的表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn)，以未春化的蓮座葉做對(duì)照，ThTOR基因的表達(dá)量在莖中最低，其次是根和萌發(fā)10天的幼苗，略低于對(duì)照；在莖生葉中最高，其次是花和果莢，春化后根和蓮座葉中的表達(dá)量也高于對(duì)照。
　　8)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，擬南芥的生長對(duì)雷帕霉素不敏感，而玉米則對(duì)雷帕霉素敏感。用雷帕霉素處理鹽芥和擬南芥，與擬南芥對(duì)照觀察鹽芥在含雷帕霉素的MS0培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況及生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在普通

17、MS0培養(yǎng)基上萌發(fā)4天后又移到含雷帕霉素的MS0培養(yǎng)基上繼續(xù)生長6天后，鹽芥和擬南芥的生長均未受到影響。用Realtime-PCR檢測其中TOR基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素幾乎沒有引起 AtTOR和ThTOR表達(dá)量的變化。
　　而直接播種在含雷帕霉素的MS0培養(yǎng)基上的鹽芥種子，幾乎不能萌發(fā)，萌發(fā)7天后，萌發(fā)率不到10％，繼續(xù)生長也不能夠萌發(fā)。擬南芥的萌發(fā)在最初的幾天也受到了抑制，但是僅僅是萌發(fā)速度有所減緩，萌發(fā)7天后，種于含雷帕霉素

18、的MS0培養(yǎng)基上的種子萌發(fā)率即達(dá)到跟對(duì)照一樣的水平。
　　本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)及意義:
　　1、首次對(duì)AtTOR的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了分析、克隆及表達(dá)分析，結(jié)合 AtTOR的表達(dá)模式，證實(shí)了啟動(dòng)子中的順式調(diào)控因子的作用；確定了AtTOR在擬南芥體內(nèi)的主要表達(dá)區(qū)域，對(duì)AtTOR基因沉默株系的表型也有了相應(yīng)解釋。
　　2、首次對(duì)AtTOR的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究，為深入研究AtTOR基因的功能打下基礎(chǔ)。
　　3、首次克隆了鹽