鹽芥中WIN1同源基因的克隆及其RNAi功能研究.pdf

1、陸生植物氣生器官的表面覆蓋著一層由蠟質(zhì)和角質(zhì)形成的脂膜，蠟質(zhì)主要由長鏈疏水物質(zhì)組成，這些物質(zhì)來源于含十六個碳或十八個碳的長鏈脂肪酸延伸復(fù)合物。蠟質(zhì)在植物的表皮上結(jié)晶形成表皮蠟質(zhì)，內(nèi)部的蠟質(zhì)與角質(zhì)等以聚合體形式存在，表皮蠟質(zhì)的功能包括調(diào)節(jié)表皮的滲透性、限制非氣孔性失水、防止紫外線的照射、抵抗細菌、真菌病原菌的入侵、阻止生殖后器官融合及花粉和雌蕊的相互作用等。角質(zhì)是構(gòu)成表皮細胞壁外保護層的主要的物質(zhì)。 對擬南芥進行大規(guī)模功能基因組

2、學(xué)研究的過程中，分離到一個具有AP2結(jié)構(gòu)域的乙烯應(yīng)答型轉(zhuǎn)錄因子(ERF)—把這個轉(zhuǎn)錄因子稱為WIN1(WAX INDUCER1)/SHN1(Atlg15360)。在擬南芥中過量表達WINI可提高參與蠟質(zhì)合成途徑中的基因的表達水平，從而顯著提高轉(zhuǎn)基因植物蠟質(zhì)的積累，引起營養(yǎng)器官和生殖器官中角質(zhì)合成增加和成分改變，增強干旱耐性及表皮滲透性。反之，下調(diào)這個基因則能引起相反的結(jié)果。其同源基因SHN2及SHN3與WIN1的功能相似。 新

3、的耐鹽模式植物鹽芥與擬南芥近緣，在遺傳特征和生活習(xí)性上與擬南芥相似，如：小的基因組，短的生活史，都是自花授粉，有豐富的種子等：在cDNA水平上與擬南芥有大約90—95％的同源性。同時，相比擬南芥，鹽芥又有很多自身的優(yōu)勢特點，如有更強的耐受性和更為豐富的表皮蠟質(zhì)等。因此，鹽芥是一種很有前景的植物蠟質(zhì)研究材料。用基因組學(xué)方法研究鹽芥，可以鑒定和克隆在擬南芥中無明顯性狀的有價值的基因，特別是與植物表皮蠟質(zhì)合成有關(guān)的基因。 為了能更深

4、一步的研究WIN1基因的作用機理，我們以鹽生植物鹽芥為材料，從中克隆了其同源基因，分析了此基因的組織表達特異性，并構(gòu)建了基因沉默及過量表達載體，以分析此基因在鹽芥蠟質(zhì)及角質(zhì)代謝中的作用及與耐逆性的關(guān)系，主要工作總結(jié)如下： 1.鹽芥WINl cDNA的克隆及序列分析 根據(jù)GeneBank中已知的WIN1類蛋白的cDNA和蛋白序列尋找保守區(qū)并合成簡并引物，提取鹽芥花的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此作為模板進行PCR擴增

5、，得到一條中間片段，經(jīng)過測序并進行Blast分析，該片段與擬南芥WIN1的同源性較高。根據(jù)已有中間片段設(shè)計特異引物利用5’—RACE和3’—RACE分別合成其5’、3’端序列，最終得到WIN1同源基因—ThWIN1。ThWIN1的cDNA序列全長846 bp，包括73 bp的5’—非編碼區(qū)和194bp的3’—非編碼區(qū)。開放閱讀框為579 bp，編碼192個氨基酸殘基，Blastx分析顯示ThWIN1氨基酸序列與擬南芥WIN1蛋白具有84

6、％的同源性。 2.ThWIN1的RT—PCR表達分析 提取鹽芥幼苗、葉、根、莖、花、角果總RNA，以內(nèi)源Actin為內(nèi)標(biāo)，設(shè)計特異引物通過半定量RT—PCR，研究了ThWIN1在鹽芥中的組織特異性表達。結(jié)果顯示ThWIN1在花中表達量最高，在莖和角果中也有表達，在葉、幼苗、根中不表達或者表達量很低而沒有檢測到。 3.ThWIN1沉默載體的構(gòu)建 將ThWIN1基因的特異區(qū)段114 bp測序正確后酶切

7、連入pRT101i中間載體，用EcoR I和BamH I雙酶切重組質(zhì)粒pRT101i—ThWIN1，回收目的片段，連入同樣雙酶切的經(jīng)過改造的pCAMBIA—3301H載體(含有CaMV35S啟動子)，得到ThWIN1沉默表達載體pCAMBIA—3301H—Th WIN1。將沉默表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，PCR鑒定挑選陽性克?。换ㄐ蚪痉ㄟM行鹽芥的基因轉(zhuǎn)化，收獲了大量的種子；以除草劑Basta進行其轉(zhuǎn)化子的篩選，獲得了14株ThWI

8、N1基因沉默構(gòu)建的鹽芥轉(zhuǎn)化子。目前已得到T1代種子。 4.ThWIN1過量表達載體的構(gòu)建 特異引物PCR多次測序正確后，將ThWIN1的開放讀碼框用BamHI和PmlI酶切后連入同樣雙酶切的植物表達載體pCAMBIA—3301H中，構(gòu)建成除草劑(Basta)作為篩選標(biāo)記的植物過量表達載體pCAMBIA—3301H—ThWIN1。將過量表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，PCR鑒定挑選陽性克??；花序浸染法進行鹽芥的基因轉(zhuǎn)化

9、，目前已獲得T0代種子。 5.利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究與ThWIN1轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白 大量法高質(zhì)量提取鹽芥花總RNA，純化mRNA，構(gòu)建鹽芥cDNA文庫，以ThWIN1為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交體系研究與ThWIN1轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白。目前已純化了高質(zhì)量的mRNA，后續(xù)工作正在進行。 本論文主要創(chuàng)新點： 1、首次從鹽芥中克隆了ThWINI基因，并對核苷酸、氨基酸序列進行了分析。