鹽芥ThCDPK9基因功能研究.pdf

1、鈣依賴蛋白激酶(Calcium-Dependent Protein Kinase/Calmodulin-like Domain ProteinKinase，CDPK)是植物和一些原生生物所特有的一類絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，可以不經(jīng)鈣調(diào)素的作用而直接被鈣信號激活。分子量一般為40～90kDa。CDPKs是一個多基因家族，其中擬南芥有34個CDPKs，水稻中有31個。 Ca2+作為植物細胞中的第二信使，在調(diào)節(jié)植物從感應環(huán)境脅迫信號

2、到下游基因的表達過程中有著關(guān)鍵作用，而CDPKs在植物鈣信號轉(zhuǎn)導中具有非常重要的作用，CDPK的活性受Ca2+、可逆磷酸化、磷脂、14-3-3蛋白的調(diào)節(jié)。CDPK有許多不同的底物，這決定了它功能的多樣性。越來越多的證據(jù)表明CDPK參與了植物碳氮代謝、磷脂合成、離子和水分跨膜運輸、細胞骨架調(diào)節(jié)、植物激素的信號轉(zhuǎn)導和代謝、生長發(fā)育調(diào)節(jié)以及生物和非生物脅迫應答反應。研究表明，擬南芥的CDPKs能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、過氧化物酶體、細胞膜、細胞質(zhì)、細胞

3、核、線粒體等部位分布。 擬南芥作為模式植物具有很多優(yōu)點，但擬南芥是典型的甜土植物，其耐鹽程度不高，而鹽芥是一種與擬南芥近緣的十字花科植物，具有很多與擬南芥相同的優(yōu)點：如形態(tài)類似、基因組小、生活史短、種子豐富和易于被轉(zhuǎn)化等。但是，鹽芥對多種脅迫的耐受能力遠遠高于擬南芥，它在短時間內(nèi)能耐受高達500mMNaCl的沖擊。 本實驗從鹽芥EST庫中得到鹽芥ThCDPK9基因，旨在研究鹽芥ThCDPK9的生物學功能，該基因全長161

4、4bp，所編碼的蛋白序列有537個氨基酸(約60kDa)。iPSORT軟件預測顯示該蛋白既沒有信號肽，也不是線粒體或葉綠體蛋白，又用PSORT軟件進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 首先構(gòu)建了鹽芥ThCDPK9-EGFP融合蛋白植物表達載體，并對洋蔥表皮進行了農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化，通過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測對鹽芥ThCDPK9的亞細胞定位進行了初步的分析，但是沒有檢測到GFP信號。為了進一步研究該蛋白的定位，還浸染了擬南芥，已得到

5、30株抗性苗。 構(gòu)建了GST-ThCDPK9載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，發(fā)現(xiàn)28℃，0.8mMIPTG誘導4h，GST-ThCDPK9融合蛋白主要以可溶性形式存在于上清中，該蛋白進一步純化后可用于研究激酶活性的測定及互作蛋白、底物的鑒定等。 構(gòu)建了鹽芥ThCDPK9的基因沉默載體，導入農(nóng)桿菌后，轉(zhuǎn)化鹽芥，用0.2％的除草劑篩選，獲得25株轉(zhuǎn)基因抗性苗。通過轉(zhuǎn)基因鹽芥中ThCDPK9的轉(zhuǎn)錄水平的檢測及轉(zhuǎn)基因鹽芥