顱腦創(chuàng)傷血清生物標(biāo)志物GFAP、UCH-L1表達(dá)及其意義.pdf

1、顱腦創(chuàng)傷因?yàn)榘l(fā)病率高、病情變化快、致死致殘率高，是醫(yī)療衛(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)的重大難題。顱腦創(chuàng)傷導(dǎo)致腦組織和細(xì)胞缺血缺氧、水腫、炎癥、神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)和生理性屏障受損等一系列復(fù)雜的生理生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元變性死亡，繼而這些細(xì)胞內(nèi)的特異成分和生化產(chǎn)物直接釋放入腦組織間液和腦脊液，并通過受損的血腦屏障或其他可能途徑進(jìn)入血液，這些腦特異蛋白被稱作生物標(biāo)志物。
　　膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白（GFAP）和泛素C末端水解酶（UCH-L1）

2、近年來分別被作為星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元損傷的標(biāo)志物，引起研究者的廣泛關(guān)注。一些研究發(fā)現(xiàn)血清GFAP、UCH-L1可反映顱腦創(chuàng)傷后腦內(nèi)損傷嚴(yán)重性和進(jìn)展情況，與顱腦創(chuàng)傷病情嚴(yán)重程度有良好的相關(guān)性，并且穩(wěn)定性、敏感度和特異度高于既往所發(fā)現(xiàn)的腦損傷生物標(biāo)志物如神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和S100B蛋白等。
　　因此，本課題研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究的角度，評(píng)估血清GFAP、UCH-L1在顱腦創(chuàng)傷后的表達(dá)水平以及與顱腦創(chuàng)傷診斷預(yù)后的相關(guān)性，

3、并以亞低溫干預(yù)為手段，驗(yàn)證生物標(biāo)志物對(duì)干預(yù)措施療效的監(jiān)測(cè)效果，從而為這些標(biāo)志物在臨床中應(yīng)用提供參考價(jià)值。
　　本課題分為四部分：一、大鼠液壓腦損傷和常溫及亞低溫治療模型的建立；二、大鼠血清GFAP、UCH-L1對(duì)低溫干預(yù)療效監(jiān)測(cè)的研究；三、顱腦創(chuàng)傷后早期血清GFAP、UCH-L1對(duì)顱腦創(chuàng)傷患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值；四、血清GFAP、UCH-L1在顱腦創(chuàng)傷臨床RCT試驗(yàn)中的初步應(yīng)用。
　　第一部分：大鼠液壓腦損傷和常溫及亞低溫治療模

4、型的建立
　　目的：建立穩(wěn)定可重復(fù)的大鼠液壓腦損傷和常溫及亞低溫治療模型，從組織學(xué)和神經(jīng)行為學(xué)角度評(píng)價(jià)模型質(zhì)量。
　　方法：雄性SD大鼠72只（體重：348-385g）隨機(jī)分配至四組：損傷常溫組（n=18），損傷亞低溫組（n=18），假損傷常溫組（n=18），假損傷亞低溫組（n=18）。對(duì)損傷亞低溫組的大鼠應(yīng)用液壓腦損傷打擊儀以1.8-2.1 ATM的壓力致傷，亞低溫治療使用冰浴降溫的方式將大鼠腦溫控制在33℃左右（波動(dòng)于3

5、2.5℃至33.5℃），維持該溫度4小時(shí)后在2小時(shí)的時(shí)間采用加熱燈或加熱墊復(fù)溫至正常體溫
　　（36-37℃）。損傷常溫組則在液壓腦損傷后采用加熱燈或加熱墊使大鼠腦溫維持在正常體溫。假損傷常溫組僅顱骨鉆孔并埋置打擊管，無液壓損傷，無降溫操作，體溫維持在36-37℃。假損傷亞低溫組大鼠進(jìn)行顱骨鉆孔并埋置打擊管，無液壓損傷，接受降溫和復(fù)溫處理。傷后24h，各組大鼠取3只進(jìn)行腦組織大體形態(tài)觀察，3只腦組織行病理HE染色，6只于傷后第1-

6、7天行橫梁行走試驗(yàn)檢測(cè)運(yùn)動(dòng)功能改變，6只于傷后第11-15天行Morris水迷宮檢測(cè)認(rèn)知功能改變。
　　結(jié)果：損傷亞低溫組和假損傷亞低溫的大鼠在執(zhí)行冰浴降溫后體溫迅速下降并達(dá)到目標(biāo)溫度（32.5-33.5℃），在維持低溫的4小時(shí)和復(fù)溫的2小時(shí)內(nèi)大鼠各項(xiàng)生理參數(shù)穩(wěn)定，與其他組大鼠無明顯差異。傷后24小時(shí)大體觀可見假損傷常溫組和假損傷亞低溫組未見明顯大腦皮層異常改變，而在損傷常溫組和損傷亞低溫組可見硬膜下出血、腦挫裂傷和蛛網(wǎng)膜下腔出血

7、出血等改變，但亞低溫組損傷程度明顯較輕。HE染色進(jìn)一步確認(rèn)亞低溫組的大鼠致傷灶周圍皮層和海馬區(qū)域損傷程度較常溫組減輕。橫梁行走試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)提示亞低溫可明顯改善腦損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功建立大鼠液壓腦損傷常溫和亞低溫治療的動(dòng)物模型，結(jié)合組織學(xué)和行為學(xué)結(jié)果，亞低溫可以提供腦損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分：大鼠血清GFAP、UCH-L1對(duì)低溫干預(yù)療效監(jiān)測(cè)的研究
　　目的：檢測(cè)亞低

8、溫對(duì)大鼠腦損傷后6h、24h血清GFAP、UCH-L1濃度和傷后24h腦組織膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元數(shù)量的影響，并行相關(guān)性驗(yàn)證。
　　方法：采用前期成功制作的大鼠液壓腦損傷常溫及亞低溫治療模型，64只雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組：假損傷常溫組，假損傷亞低溫組，損傷常溫組，損傷亞低溫組（各組n=16）。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)前埋置打擊管后（基線）、傷后6h、傷后24h取全血500-800ul，并提取血清檢測(cè)GFAP、UCH-L1濃度。傷后24h，各組大

9、鼠中的8只取腦組織行石蠟切片GFAP免疫組化，對(duì)皮層和海馬CA2/3區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)；另外8只腦組織行冰凍切片F(xiàn)luoro-Jade B熒光染色，對(duì)皮層和海馬CA2/3區(qū)域的變性神經(jīng)元計(jì)數(shù)。采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)分別對(duì)傷后6h、24h血清GFAP濃度與傷后24h星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量做相關(guān)分析，并分別對(duì)傷后6h、24h血清UCH-L1濃度與傷后24h變性神經(jīng)元數(shù)量做相關(guān)分析。
　　結(jié)果：亞低溫對(duì)假損傷大鼠的血清GFAP、UCH

10、-L1濃度無明顯影響。亞低溫可降低傷后6h、傷后24h血清GFAP濃度（P=0.0017和P=0.043），同時(shí)可降低傷后6h血清UCH-L1濃度（P=0.0013），可降低傷后24h血清UCH-L1濃度，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.162）。組織病理學(xué)顯示亞低溫可降低皮層和海馬CA2/3區(qū)域受損膠質(zhì)細(xì)胞和變性神經(jīng)元的數(shù)量。相關(guān)分析結(jié)果提示傷后6h、傷后24h血清GFAP濃度均與腦內(nèi)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量有明顯相關(guān)性（傷后6h：R=-0.61

11、6，P=0.0002；傷后24h：R=-0.313，P=0.0132），傷后6h的相關(guān)程度最強(qiáng)。傷后6h血清UCH-L1濃度與腦內(nèi)Fluoro-Jade B陽性細(xì)胞數(shù)量有相關(guān)性（R=0.365，P=0.0399），傷后24h的血清UCH-L1與腦內(nèi)Fluoro-Jade B陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯相關(guān)性（R=0.272，P=0.132）。
　　結(jié)論：亞低溫可降低血清GFAP、UCH-L1濃度，并可減輕腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元損傷。傷后6h的

12、血清GFAP具有明顯的干預(yù)措施療效判別作用，可反應(yīng)腦組織損傷和保護(hù)情況。血清GFAP在監(jiān)測(cè)低溫干預(yù)療效的價(jià)值可能高于UCH-L1。
　　第三部分：顱腦創(chuàng)傷后早期血清GFAP、UCH-L1對(duì)顱腦創(chuàng)傷患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值
　　目的：評(píng)估顱腦創(chuàng)傷后早期（傷后4小時(shí)內(nèi)）血清GFAP濃度對(duì)患者傷后6個(gè)月預(yù)后的預(yù)測(cè)能力。
　　方法：納入2012年3月至2014年9月因重型顱腦創(chuàng)傷在上海仁濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)外科就診的成年患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為：年齡

13、>18周歲，性別不限，受傷時(shí)間為入院前4小時(shí)內(nèi)且入院時(shí)GCS評(píng)分為3-8分。排除標(biāo)準(zhǔn)為：頭部外傷合并其他系統(tǒng)器官的嚴(yán)重外傷、入院時(shí)生命體征不平穩(wěn)和妊娠期婦女。此外，選取135例既往無顱腦創(chuàng)傷和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的健康志愿者作為對(duì)照組。抽取健康志愿者和患者入院時(shí)的外周靜脈血3-5ml并提取血清檢測(cè)GFAP、UCH-L1濃度。對(duì)顱腦創(chuàng)傷患者進(jìn)行傷后6個(gè)月的隨訪，根據(jù)GOS評(píng)分分為死亡和存活、預(yù)后不良（死亡+植物生存+重度殘疾）和預(yù)后良好（中度

14、殘疾+恢復(fù)良好）兩類結(jié)局指標(biāo)，并對(duì)血清GFAP、UCH-L1預(yù)測(cè)患者預(yù)后的準(zhǔn)確性進(jìn)行ROC分析。
　　結(jié)果：一共67例重型顱腦創(chuàng)傷患者納入研究，平均入院時(shí)間為傷后2.6小時(shí)，GCS評(píng)分中位值為6分。傷后6個(gè)月隨訪時(shí)發(fā)現(xiàn)患者死亡27例，死亡率40.3%；預(yù)后不良患者(死亡+植物生存+重度殘疾)35例，預(yù)后不良率52.2%。與健康志愿者相比，重型顱腦創(chuàng)傷患者入院時(shí)血清GFAP、UCH-L1濃度明顯升高（均P<0.001）。ROC分析結(jié)

15、果提示，入院時(shí)血清GFAP、UCH-L1具有預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，GFAP對(duì)死亡的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度AUC=0.761，對(duì)預(yù)后不良的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度AUC=0.823，血清UCH-L1對(duì)死亡的預(yù)測(cè)AUC=0.722，對(duì)不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值A(chǔ)UC=0.728。這兩種血清標(biāo)志物對(duì)死亡或不良預(yù)后預(yù)測(cè)的能力均高于年齡（AUC=0.592和0.617）、GCS評(píng)分（AUC=0.702和0.711）和瞳孔反應(yīng)（AUC=0.655和0.705）等臨床指標(biāo)。
　　結(jié)論：

16、顱腦創(chuàng)傷早期的血清GFAP、UCH-L1具有預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，且預(yù)測(cè)能力高于年齡、GCS評(píng)分和瞳孔反應(yīng)等臨床指標(biāo)。
　　第四部分：血清GFAP、UCH-L1在顱腦創(chuàng)傷臨床RCT試驗(yàn)初步應(yīng)用
　　目的：評(píng)估血清GFAP、UCH-L1用于顱腦創(chuàng)傷臨床RCT試驗(yàn)中作為替代指標(biāo)的可行性。
　　方法：LTH-1試驗(yàn)是由中國15家三級(jí)甲等醫(yī)院協(xié)同開展的前瞻性多中心隨機(jī)對(duì)照研究，旨在評(píng)估長時(shí)程低溫（34-35℃）治療重型顱腦創(chuàng)傷（GCS

17、4-8分）患者的療效和安全性。本研究選取上海仁濟(jì)醫(yī)院納入并完成隨訪的14例重型顱腦創(chuàng)傷患者，收集入院時(shí)、入院后1-6天共計(jì)7天的外周靜脈血并提取血清，檢測(cè)GFAP、UCH-L1濃度，觀察亞低溫對(duì)患者血清GFAP、UCH-L1濃度的影響，并通過傷后6個(gè)月的隨訪數(shù)據(jù)初步了解長時(shí)程低溫的療效及血清GFAP、UCH-L1作為顱腦創(chuàng)傷臨床RCT試驗(yàn)替代指標(biāo)的可能性。
　　結(jié)果：自2013年11月12日至2015年9月2日，14例患者符合標(biāo)準(zhǔn)

18、入組并完成隨訪，平均年齡42.25±10.3周歲，性別、入院GCS評(píng)分、致傷原因、瞳孔反應(yīng)等指標(biāo)在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在傷后6天的觀察時(shí)間內(nèi)，兩組患者的血清GFAP、UCH-L1濃度均有所降低。對(duì)比入院時(shí)，傷后第6天亞低溫組患者血清GFAP濃度降低程度較常溫組更為明顯（ΔGFAP：2.009（0.354-3.711）vs1.08（0.193-2.366）ng/ml，P<0.01），亞低溫組患者血清UCH-L1濃度降低較常溫組更多（ΔUC

19、H-L1：0.456（0.091-0.842）vs0.175（0.041-0.552），P<0.05）。傷后6個(gè)月隨訪顯示亞低溫和常溫對(duì)照組死亡率分別為28.6%和57.2%（P=0.28）、兩組不良預(yù)后率分別為42.8%和71.4%（P=0.28），但由于樣本量僅14例患者，造成統(tǒng)計(jì)學(xué)效能不足，待多中心300例樣本量全部完成后才能確定長時(shí)程亞低溫的療效。
　　結(jié)論：長時(shí)程亞低溫療法可降低患者傷后6天的血清GFAP、UCH-L1濃