基因定點(diǎn)修飾多片段載體的構(gòu)建.pdf

1、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶（TALEN），是人工制備的可以對(duì)選定位置的 DNA序列進(jìn)行雙鏈切斷的核酸內(nèi)切酶，由 FoKI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域和 TALE結(jié)構(gòu)域融合而成，TALENs可以對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾如基因敲除、基因敲進(jìn)和基因修改等。
　　構(gòu)建TALENs載體和含有目的基因兩側(cè)同源序列的基因打靶載體是開展下游基因定點(diǎn)修飾工作的基礎(chǔ)，而 TALENs載體和同源臂打靶載體都是由多個(gè) DNA片段組成的，因此如何快速構(gòu)建這些多片段連接的基

2、因定點(diǎn)修飾載體是本文研究的主要內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)利用Go lde n ga te克隆方法的基本原理在Too lBo x方法的基礎(chǔ)上建立了一套快速、穩(wěn)定構(gòu)建TALENs載體的方法；同時(shí)進(jìn)一步改進(jìn)Go lde n ga te克隆方法，建立了一套可以快速構(gòu)建同源臂多片段載體的方法。我們分兩步構(gòu)建了一對(duì)針對(duì)EGFP基因的TALENs載體，每個(gè)載體由19個(gè)片段連接而成，首先在設(shè)計(jì)的引物中加入BsaI、BsmBI酶切位點(diǎn)，將PCR擴(kuò)增的6個(gè)片段一組與改造

3、的pMD19-T載體在一個(gè)PCR反應(yīng)管中同時(shí)進(jìn)行酶切和酶連反應(yīng)；第二步，把3個(gè)連入 T載體的質(zhì)粒與最后的真核表達(dá)載體質(zhì)粒一起進(jìn)行一步酶切和酶連接反應(yīng)，最終構(gòu)建完成TALENs載體。利用改進(jìn)的Go lde n ga te克隆技術(shù)構(gòu)建了同源臂打靶載體，將pMD19-T載體進(jìn)行改造，在Lac Z基因兩側(cè)加入BsaI酶位點(diǎn)使其能夠被多次重復(fù)使用，利用相同的方法對(duì)pMD19-T中的BsaI酶切位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，擴(kuò)增出的加入BsaI酶切位點(diǎn)的多條同源