IT15基因片段真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、本文擬通過基因重組技術(shù)構(gòu)建內(nèi)亨廷頓舞蹈病(Huntingtondisease,HD)患者的IT15基因片段真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞和非神經(jīng)元Hela細(xì)胞，表達(dá)變異Htt的N端片段模擬HD的發(fā)病，建立HD細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究HD的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在細(xì)胞水平上研究丁酸鈉對于HD的保護(hù)作用。初步探討Htt的N端片段的出核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。 研究材料與方法：研究對象來自一個(gè)浙江省連續(xù)4代發(fā)病的HD家系。選擇該家系內(nèi)一C

2、AG重復(fù)拷貝數(shù)高達(dá)68次的患者及CAG重復(fù)拷貝數(shù)為17次的正常人，抽提他們的基因組DNA，PCR擴(kuò)增IT15基因1號外顯子片段(包含IT15基因1號外顯子的1-53個(gè)密碼子，計(jì)數(shù)以含有17個(gè)連續(xù)CAG重復(fù)拷貝的IT15基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn))，將PCR擴(kuò)增的目的片段裝入pEGFP-C1，構(gòu)建GFP-Htt-19Q(野生型)、GFP-mHtt-70Q(突變型)真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞和非神經(jīng)元細(xì)胞Hela細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察變異

3、Htt在SH-SY5Y細(xì)胞和Hela細(xì)胞內(nèi)的分布定位及聚集情況。WesternBlot證實(shí)Htt的N端片段在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-Htt-19Q、GFP-mHtt-70Q的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。通過MTT測定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-Htt-19Q、GFP-mHtt-70Q的SH-SY5Y細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)及流式細(xì)胞術(shù)計(jì)算SH-SY5Y細(xì)胞死亡率研究變異Htt對神經(jīng)元細(xì)胞的毒性作用及丁酸鈉的保護(hù)作用。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-Htt-19Q、GFP-mHtt-

4、70Q的Hela細(xì)胞經(jīng)特異性核輸出抑制劑LeptomycinB處理2小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察目的蛋白的亞細(xì)胞定位改變。構(gòu)建下列真核表達(dá)載體：GFP-Htt-19Q-S1(包含IT15基因1號外顯子的2-53個(gè)密碼子)、GFP-Htt-19Q-S3(包含IT15基因1號外顯子的4-53個(gè)密碼子)、GFP-Htt-19Q-S5(包含IT15基因1號外顯子的6-53個(gè)密碼子)、GFP-Htt-19Q-S7(包含IT15基因1號外顯子的8-53個(gè)

5、密碼子)。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察缺失Htt起始1個(gè)氨基酸(GFP-Htt-19Q-S1)、3個(gè)氨基酸(GFP-Htt-19Q-S3)、5個(gè)氨基酸(GFP-Htt-19Q-S5)、7個(gè)氨基酸(GFP-Htt-19Q-S7)的N端片段在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位。 研究結(jié)果：成功構(gòu)建IT15基因片段真核表達(dá)載體GFP-Htt-19Q(野生型)、GFP-mHtt-70Q(變異型)。轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞和Hela細(xì)胞。變異

6、Htt的N端片段主要分布于SH-SY5Y細(xì)胞和Hela細(xì)胞的胞質(zhì)中，部分變異Htt的N端片段入核并在核內(nèi)及核周形成聚集物，隨著轉(zhuǎn)染后時(shí)間的延長，聚集物逐漸增多，正常Htt的N端片段始終彌散分布于胞質(zhì)中。WesternBlot證實(shí)Htt的N端片段在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)染GFP-mHtt-70Q的SH-SYSY細(xì)胞的吸光度值較對照組相比明顯下降、其細(xì)胞死亡率明顯增加。0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.5mmol/l、1.0

7、mmol/l丁酸鈉處理后均可以緩解這種變異Htt誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。但丁酸鈉在緩解SH-SY5Y細(xì)胞死亡率的同時(shí)并不抑制SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)變異Htt聚集物的形成。轉(zhuǎn)染GFP-Htt-19Q和GFP-mHtt-70Q的Hela細(xì)胞經(jīng)10ng/ml的LeptomycinB處理2小時(shí)后，熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)正常Htt的N端片段由處理前的主要分布于胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)樘幚砗蟮膹浬⒎植加诎|(zhì)胞核內(nèi)，變異Htt的N端片段則較LeptomycinB處理前更

8、多地在核內(nèi)駐留。成功構(gòu)建GFP-Htt-19Q-S1、GFP-Htt-19Q-S3、GFP-Htt-19Q-S5、GFP-Htt-19Q-S7真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)缺失Htt起始1個(gè)氨基酸、3個(gè)氨基酸的正常Htt的N端片段彌散分布于胞質(zhì)內(nèi)，缺失Htt起始5個(gè)氨基酸、7個(gè)氨基酸的正常Htt的N端片段均勻分布于胞質(zhì)胞核內(nèi)。說明缺失了Htt起始3個(gè)氨基酸的Htt的N端片段仍有出核功能，而缺失了Htt起始5個(gè)氨基

9、酸的Htt的N端片段不具有出核功能。 研究結(jié)論：成功構(gòu)建了IT15基因片段真核表達(dá)載體pEGFP-C1-19Q(野生型)、pEGFP-C1-70Q(突變型)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞和非神經(jīng)元Hela細(xì)胞，成功建立了HD細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究HD的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。明確了丁酸鈉能夠直接保護(hù)神經(jīng)元對抗變異Htt的N端片段的毒性作用，但并不抑制變異Htt聚集物的形成，變異Htt聚集物與神經(jīng)元的死亡無必然聯(lián)系。組蛋白乙?；?/p>

10、水平的改變導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的異?？赡苁亲儺怘tt的N端片段毒性作用的關(guān)鍵，糾正這種改變了的組蛋白乙?；脚c異常的基因轉(zhuǎn)錄可延緩HD的進(jìn)程。丁酸鈉可直接針對HD細(xì)胞起作用，阻斷病變細(xì)胞的死亡。正常情況下Htt的N端片段能入核，并且入核后能通過出核介導(dǎo)物CRM1(exportin1)介導(dǎo)的途徑出核，這種出核途徑可被LeptomycinB抑制。發(fā)現(xiàn)缺失了Htt起始5個(gè)氨基酸的Htt的N端片段失去了出核作用。推測Htt起始的第4到17個(gè)氨基酸參與