篩選攜帶ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒載體.pdf

1、 目的：篩選能夠顯著抑制自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi) Rho 關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶 2 ( Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2,ROCK2)基因表達(dá)的攜帶 siRNA 的慢病毒載體。方法：1.采用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞。2.靶向大鼠ROCK2基因設(shè)計(jì)具有基因特異性的小干擾 RNA(small interferen

2、ce RNA,siRNA),構(gòu)建其短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA, shRNA)重組慢病毒表達(dá)載體。①設(shè)計(jì)RNAi 靶點(diǎn)序列并合成靶序列的 Oligo DNA,退火形成雙鏈 DNA,與經(jīng)Hpa I、XhoI進(jìn)行酶切后的GP-Supersilencing Vector載體連接產(chǎn)生 shRNA 慢病毒載體。②轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性菌落、擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,進(jìn)行 DNA 測(cè)序鑒定。③GP-Supersilen

3、cing Vector與三種混合包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生shRNA 重組慢病毒。 3.隨機(jī)將5只SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞分為6組(每組n=5),每組每個(gè)樣本3×104個(gè)細(xì)胞,分別為：A組(未轉(zhuǎn)染對(duì)照組)、B組(攜帶慢病毒轉(zhuǎn)染組)、C~F組(分別攜帶靶向ROCK2基因的siRNA1~4號(hào)靶點(diǎn)的慢病毒轉(zhuǎn)染組),以MOI=80轉(zhuǎn)染SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48小時(shí)熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP表達(dá)情況,并用RT-PCR檢測(cè)各

4、組被轉(zhuǎn)染細(xì)胞ROCK2基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果：1.經(jīng)酶切及基因測(cè)序鑒定證實(shí)重組慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞感染效率均大于 50%。3.RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組ROCK2 mRNA的表達(dá)：與A組相比,B組ROCK2基因mRNA的表達(dá)無明顯改變(P﹥0.05)；C組、D組、F組SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞ROCK2基因mRNA的表達(dá)較A組極顯著下降(P<0.01),抑制效率分別達(dá)到43.91±8.19℅、47