胃癌耐藥相關(guān)microRNA表達(dá)譜及miR-17-5p逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞耐藥作用的研究.pdf

1、胃癌是全球腫瘤致死主要原因之一，在我國是僅次于肺癌死亡率排名第二的惡性腫瘤?；熓俏赴┲委煹闹匾侄沃弧Ｎ赴┘?xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致胃癌化療失敗的主要原因之一。胃癌患者如果對化療出現(xiàn)耐藥情況，預(yù)后較差，所以明確胃癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制十分重要。
　　microRNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼小RNA分子，它們通過調(diào)節(jié)靶基因mRNA的翻譯或降解而起到調(diào)節(jié)基因的作用。miRNA在腫瘤中通過對下游靶基因的調(diào)節(jié)，對其發(fā)生與發(fā)展起

2、到至關(guān)重要的作用。近年來的研究證實(shí)了miRNA在抗腫瘤藥物的敏感性和耐藥性中起了重要作用。以特定的miRNA為治療靶點(diǎn)，通過比較miRNA表達(dá)譜，與腫瘤細(xì)胞耐藥性密切相關(guān)的特定miRNA將被識別，這可能為新的靶向治療方案開辟途徑，從而改善治療效果。然而miRNA影響胃癌細(xì)胞耐藥性的作用機(jī)制并不明了。因此準(zhǔn)確尋找對胃癌耐藥細(xì)胞影響較大的miRNA并探討其作用機(jī)制，成為亟待解決的重要問題。本研究擬在兩種耐藥胃癌細(xì)胞SGC7901/DDP和B

3、GC823/5-FU中篩選出與親本細(xì)胞表達(dá)差異較大的miRNA，并深入探討其對細(xì)胞耐藥性的影響作用及其作用機(jī)制。
　　目的:
　　在兩種耐藥胃癌細(xì)胞SGC7901/DDP和BGC823/5-FU中分析miRNA表達(dá)譜，篩選耐藥相關(guān)特異性miRNA;研究耐藥相關(guān)miRNA對胃癌細(xì)胞株耐藥性的影響;尋找潛在靶點(diǎn)，探討其作用分子機(jī)制，以期為新的靶向治療方案開辟途徑。
　　方法:
　　采用基因芯片技術(shù)分別檢測胃癌細(xì)胞SG

4、C7901及其耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP、胃癌細(xì)胞BGC823及其耐藥細(xì)胞BGC823/5-FU的miRNA的表達(dá)差異情況，尋找在兩株胃癌耐藥細(xì)胞中與親本細(xì)胞之間尋找表達(dá)差異較大的miRNA，并采用實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。通過體外轉(zhuǎn)染抑制序列anti-miR-17-5p序列下調(diào)細(xì)胞中的miR-17-5p表達(dá)，CCK-8法分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對長春新堿、阿霉素、5-氟尿嘧啶和順鉑的藥物敏感性變化。運(yùn)用生物信息學(xué)工具PicTar和Mira

5、nda algorithms預(yù)測miR-17-5p的靶基因。構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-p21-3'-UTR驗(yàn)證miR-17-5p與預(yù)測靶基因p21的相互作用。通過WesternBlot方法檢測胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP和BGC823/5-FU中miR-17-5p對p21的調(diào)控作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-17-5p對胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP和BGC823/5-FU細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測miR

6、-17-5p對胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP和BGC823/5-FU細(xì)胞生長的影響。
　　結(jié)果:
　　基因芯片分析結(jié)果顯示:與SGC7901細(xì)胞相比，SGC7901/DDP細(xì)胞中miR-17-5p的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01);BGC823/5-FU細(xì)胞中miR-17-5p的表達(dá)較BGC823細(xì)胞明顯上調(diào)（P＜0.01）。實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析結(jié)果顯示:耐藥SGC7901/DDP與BGC823/5-FU細(xì)胞中miR-1

7、7-5p表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.01）。抑制SGC7901/DDP細(xì)胞和BGC823/5-FU細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)可有效提高細(xì)胞對順鉑、阿霉素、長春新堿和5-FU的藥物敏感性(P＜0.05)。根據(jù)生物信息學(xué)工具的預(yù)測miR-17-5p的靶基因可能為p21。對p21基因3'非編碼區(qū)報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性測定顯示miR-17-5p可顯著降低pGL3-p21-3'-UTR相對熒光酶活性（P＜0.05）。在胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/

8、DDP和BGC823/5-FU中抑制miR-17-5p表達(dá)可明顯增加p21蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。抑制miR-17-5p表達(dá)還可抑制胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP和BGC823/5-FU的生長(P＜0.05)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。在胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP和BGC823/5-FU中抑制miR-17-5p表達(dá)可使G1期細(xì)胞明顯減少，而S期細(xì)胞明顯增多，引起細(xì)胞周期G1-S期阻滯(P＜0.05)。
　　結(jié)

9、論:
　　與親代非耐藥胃癌細(xì)胞相比，miR-17-5p在耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP和BGC823/5-FU細(xì)胞中表達(dá)顯著增高。抑制miR-17-5p表達(dá)可明顯改善胃癌細(xì)胞耐藥性，同時(shí)抑制胃癌耐藥細(xì)胞的生長活力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡病引起細(xì)胞周期G1-S期阻滯。究其分子機(jī)制，miR-17-5p可能是通過調(diào)控其靶基因p21的表達(dá)影響胃癌耐藥細(xì)胞的凋亡和增殖。本研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p的表達(dá)可明顯降低胃癌細(xì)胞的耐藥性，為臨床上克服胃癌化療