IL28B基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者對干擾素應答的關系.pdf

1、背景:乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)感染是最嚴重的，廣泛流行的世界健康問題之一，全球受累患者高達20億。目前世界范圍內仍有超過3.5億的慢性攜帶者，其中85％生活在亞太地區(qū)。感染HBV的人群處于發(fā)生肝臟失代償、肝硬化和肝細胞癌的高風險中。據估計，HBV感染者全球的年病死率為50萬～120萬。HBV的自然史極為復雜，從自限性感染到慢性感染，從急性肝炎到慢性肝炎，嚴重者尚可出現肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌。在需要進行治療

2、的感染者中，慢性乙型肝炎(ChronicHepatitisB，CHB)患者占了大多數。HBV的復制是導致肝損傷和疾病進展的關鍵。因此，治療的主要目標是抑制病毒復制直至檢測不到病毒DNA，獲得HBeAg血清學轉換，或者同時達到這兩項;以終止或減少肝臟的壞死性炎癥;預防肝臟失代償;長期目標是減少肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生，最終延長存活期。在除外其他干擾因素的情況下，ALT水平持續(xù)超過正常上限的2倍或有顯著的肝臟損傷時應采用藥物治療。
　　

3、 目前抗病毒治療的藥物分兩大類:一類是α干擾素（包括普通干擾素和長效干擾素），一類是核苷（酸）類似物。兩類藥物有不同的作用機制。核苷（酸）類似物直接作用于病毒，在抑制病毒和降低復制方面非常有效。與干擾素相比，核苷（酸）類似物有它的優(yōu)缺點。首要的問題是，核苷（酸）類似物的治療時間是不明確的，并可能是維持終身的。核苷（酸）類似物誘導的HBeAg血清轉換率與治療的時間成正比，一旦停止治療，大多數患者(～80％)將復發(fā)，即HBeAg復陽。同時

4、，患者還要面對耐藥的風險，一旦發(fā)生耐藥，意味著起初抗病毒治療產生的臨床和組織學獲益均會消失。其優(yōu)點是安全，高效，且服用方便。干擾素(Interferon，IFN)具有免疫調節(jié)作用，可影響宿主的免疫系統。有研究證實在干擾素治療結束后隨訪6個月的患者中，HBeAg的血清轉換率繼續(xù)升高，一旦在治療結束后獲得治療反應，HBeAg血清學轉換反應在約70-87％的患者中持續(xù)存在。因此，干擾素是慢性乙型肝炎的理想治療手段。
　　 對于代償性肝

5、病患者應首選IFN治療，特別是年輕患者、育齡婦女和ALT值低的患者，因為IFN的治療周期比較固定、能獲得持續(xù)性的治療反應，且具有包括預防肝細胞癌在內的長期效益。然而，在完成4-6個月普通干擾素治療的HBeAg(+)的CHB患者中，只有25％-33％達到了血清轉換。而在完成12或者24個月普通干擾素治療的HBeAg(-)CHB患者當中，達到生化學應答和病毒學應答的比例為22％-30％。為何只有部分病人能獲得治療應答，這是個有待深入研究的課

6、題。在HBeAg(+)的CHB，預測干擾素良好應答的因素有ALT＞200U/L，HBVDNA＜1000pg/mL，女性，活動的肝纖維化等;病毒因素中，D型和C型對干擾素的反應要差于A型和B型。
　　 在宿主遺傳背景方面，單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)會影響個體對疾病的易感性和對藥物治療的反應，這已經在多種疾病中得到證實。特別在乙型肝炎，MHCⅠ、MHCⅡ、TNF-α、甘露糖相關

7、蛋白等基因的SNPs能影響宿主的免疫系統和抗病毒反應，從而影響疾病的進程（如耐受狀態(tài)，感染慢性化等）和治療反應。因此，對SNPs的研究可以發(fā)現預測慢性乙型肝炎患者對干擾素治療反應的重要因素，從而在預測患者可能無法獲得良好應答的情況下，避免不必要的藥物不良反應和節(jié)省醫(yī)療費用。
　　 IL28B(interferon-λ3)主要通過JAK-STAT信號途徑，誘導磷酸化，上調干擾素激活相關基因(IFNstimulatedgenes，I

8、SGs)表達，產生一些抗病毒蛋白，從而發(fā)揮抗病毒效應。IL28B被認為是調控對HCV免疫反應的關鍵免疫分子，其基因上一些單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)，特別是SNPrs12979860和SNPrs8099917，已經證實與HCV的自發(fā)清除和治療反應高度相關。HBV與HCV有相類似的免疫機制，IFN-α和ISGs在宿主抗病毒的反應當中均具有重要作用。上述SNP位點是否能影響HBV的治療反應，值得進一步研究。
　　 目的:通過研究IL

9、28B基因主要SNP(rs12979860和rs8099917)在接受干擾素治療的HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者中的分布規(guī)律，闡明IL28B及其基因與干擾素治療應答的關系，在遺傳背景方面尋找影響干擾素療效的預測因素，為慢性乙型肝炎的個體化治療提供參考依據，并為深入研究干擾素治療作用的確切機制提供線索。
　　 方法:采集入組的82例應用干擾素治療的患者的外周血（38例對干擾素應答，44例對干擾素不應答）。從外周血中提取全基因組DN

10、A，并擴增IL28B基因。SNPrs8099917用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性法（PCR-RLFP法）進行基因分型，SNPrs12979860通過直接測序進行基因分型。PCR-RLFP法是基于PCR原理和核酸特異性酶切反應原理的一種SNP基因分型方法。具有具有簡單，快速，經濟，準確性高等優(yōu)點。限制性內切酶是分子生物學中研究基因變異的一把手術刀，可以特異性切割所識別的堿基序列，利用這個特點，可以檢測基因片段中某一位點是否存在變異

11、，即可對某SNP進行基因分型。IL28B基因SNPrs8099917對應BsrD1的限制性內切酶的酶切位點，當該位點堿基為G時，存在此內切酶的酶切位點，而當G變異為T后此酶切位點消失，因此，酶切后有3種情況:一是酶切后PCR產物長度無變化，電泳圖譜僅出現1條帶，說明此擴增片段無此酶的酶切位點即為TT基因型;二是雜合型，即一條染色體上有此酶的切點，而另一條染色體上的等位基因沒有此酶切位點，電泳圖譜出現3條帶，即為CG基因型;三是PCR產物

12、被完全切開，電泳圖譜僅出現2條帶，說明兩條染色體均有此酶的切點，為純合型，即為GG基因型。在對SNPrs8099917進行基因分型時，隨機挑選部分樣本進行直接測序以證實PCR-RLFP法結果的可靠性。擴增各病例血清中的HBVDNA，擴增產物直接測序進行基因分型。對分型結果進行統計學分析。
　　 結果:82例應用干擾素治療的HBeAg陽性慢乙肝患者的IL28B基因片段均成功擴增。對SNPrs8099917進行分型時，其PCR-RL

13、FP結果清晰，并能被直接測序的結果加以證實;而對SNPrs12979860進行時，所有片段均直接測序成功。全部病例HBVDNA均成功擴增并成功分型。在干擾素治療應答組和非應答組，兩者間的基因型均只有B型和C型，構成比在兩組間無統計學差異。在干擾素治療應答組，SNPrs8099917基因型TT,TG+GG的比例分別是81.6％(31/38)和18.4％(7/38)，等位基因G和T的基因頻率是9.2％(7/76)和90.8％(69/76)，

14、在干擾素治療非應答組，SNPrs8099917基因型TT,TG+GG的比例分別是97.7％(43/44)，2.3％(1/44)，等位基因G和T的基因頻率分別是1.1％(1/88)和98.9％(87/88)，兩組間的差異有統計學意義(基因型P=0.014;基因頻率P=0.025)。SNPrs12979860位點等位基因C和T的基因頻率在在應答組分別為92.1％(70/76)和7.9％(6/76)，在非應答組為97.7％(86/88)和2.

15、3％(2/88)，基因型TT+CT和CC的比例在應答組分別為15.8％(6/38)和84.2％(32/38)，在非應答組為4.5％(2/44)和95.5％(42/44)?；蝾l率和基因型頻率在干擾素治療應答組和非應答組均無統計學差異(P＞0.05)。
　　 結論:(1)IL28B基因SNPrs8099917的CG+GG基因型頻率和等位基因G的頻率在應答組和非應答組之間存在統計學差異（見表）。提示G等位基因可能與慢性乙型肝炎患者對

16、干擾素治療的有效應答相關，提示該SNP位點可能通過影響IL28B的表達，后者作用于宿主對HBV的免疫反應，進而影響對干擾素應答的個體反應。(2)IL28B是影響HCV自然清楚和治療反應的關鍵免疫分子，但目前尚不清楚IL28B基因如何影響HCV的預后。盡管HBV有和HCV相近似的免疫機制，比如一樣對干擾素治療有反應，IL28B在兩者中的機制是否一樣，尚需進一步探討。(3)rs8099917可望成為抗病毒治療中病例選擇和療效預測的遺傳學標志

17、。本研究是一個初步的探討性研究，下一步可通過擴大樣本量來驗證其預測作用的大小。(4)SNPrs12979860的基因型頻率和基因頻率在干擾素治療應答組和非應答組之間并未觀察到有意義的統計學差異。目前尚不能否定其意義，因rs12979860位點和rs8099917位點之間存在連鎖不平衡，擴大觀察樣本量，或許可進一步證實其所起的作用。(5)鑒于rs8099917與兩種最常見慢性病毒性肝病的相關性，及其已經被證實的在HCV中的關鍵作用，rs8