IL28B基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者對(duì)干擾素應(yīng)答的關(guān)系.pdf

1、背景:乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)感染是最嚴(yán)重的，廣泛流行的世界健康問(wèn)題之一，全球受累患者高達(dá)20億。目前世界范圍內(nèi)仍有超過(guò)3.5億的慢性攜帶者，其中85％生活在亞太地區(qū)。感染HBV的人群處于發(fā)生肝臟失代償、肝硬化和肝細(xì)胞癌的高風(fēng)險(xiǎn)中。據(jù)估計(jì)，HBV感染者全球的年病死率為50萬(wàn)～120萬(wàn)。HBV的自然史極為復(fù)雜，從自限性感染到慢性感染，從急性肝炎到慢性肝炎，嚴(yán)重者尚可出現(xiàn)肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌。在需要進(jìn)行治療

2、的感染者中，慢性乙型肝炎(ChronicHepatitisB，CHB)患者占了大多數(shù)。HBV的復(fù)制是導(dǎo)致肝損傷和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵。因此，治療的主要目標(biāo)是抑制病毒復(fù)制直至檢測(cè)不到病毒DNA，獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，或者同時(shí)達(dá)到這兩項(xiàng);以終止或減少肝臟的壞死性炎癥;預(yù)防肝臟失代償;長(zhǎng)期目標(biāo)是減少肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生，最終延長(zhǎng)存活期。在除外其他干擾因素的情況下，ALT水平持續(xù)超過(guò)正常上限的2倍或有顯著的肝臟損傷時(shí)應(yīng)采用藥物治療。
　　

3、 目前抗病毒治療的藥物分兩大類:一類是α干擾素（包括普通干擾素和長(zhǎng)效干擾素），一類是核苷（酸）類似物。兩類藥物有不同的作用機(jī)制。核苷（酸）類似物直接作用于病毒，在抑制病毒和降低復(fù)制方面非常有效。與干擾素相比，核苷（酸）類似物有它的優(yōu)缺點(diǎn)。首要的問(wèn)題是，核苷（酸）類似物的治療時(shí)間是不明確的，并可能是維持終身的。核苷（酸）類似物誘導(dǎo)的HBeAg血清轉(zhuǎn)換率與治療的時(shí)間成正比，一旦停止治療，大多數(shù)患者(～80％)將復(fù)發(fā)，即HBeAg復(fù)陽(yáng)。同時(shí)

4、，患者還要面對(duì)耐藥的風(fēng)險(xiǎn)，一旦發(fā)生耐藥，意味著起初抗病毒治療產(chǎn)生的臨床和組織學(xué)獲益均會(huì)消失。其優(yōu)點(diǎn)是安全，高效，且服用方便。干擾素(Interferon，IFN)具有免疫調(diào)節(jié)作用，可影響宿主的免疫系統(tǒng)。有研究證實(shí)在干擾素治療結(jié)束后隨訪6個(gè)月的患者中，HBeAg的血清轉(zhuǎn)換率繼續(xù)升高，一旦在治療結(jié)束后獲得治療反應(yīng)，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換反應(yīng)在約70-87％的患者中持續(xù)存在。因此，干擾素是慢性乙型肝炎的理想治療手段。
　　 對(duì)于代償性肝

5、病患者應(yīng)首選IFN治療，特別是年輕患者、育齡婦女和ALT值低的患者，因?yàn)镮FN的治療周期比較固定、能獲得持續(xù)性的治療反應(yīng)，且具有包括預(yù)防肝細(xì)胞癌在內(nèi)的長(zhǎng)期效益。然而，在完成4-6個(gè)月普通干擾素治療的HBeAg(+)的CHB患者中，只有25％-33％達(dá)到了血清轉(zhuǎn)換。而在完成12或者24個(gè)月普通干擾素治療的HBeAg(-)CHB患者當(dāng)中，達(dá)到生化學(xué)應(yīng)答和病毒學(xué)應(yīng)答的比例為22％-30％。為何只有部分病人能獲得治療應(yīng)答，這是個(gè)有待深入研究的課

6、題。在HBeAg(+)的CHB，預(yù)測(cè)干擾素良好應(yīng)答的因素有ALT＞200U/L，HBVDNA＜1000pg/mL，女性，活動(dòng)的肝纖維化等;病毒因素中，D型和C型對(duì)干擾素的反應(yīng)要差于A型和B型。
　　 在宿主遺傳背景方面，單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)會(huì)影響個(gè)體對(duì)疾病的易感性和對(duì)藥物治療的反應(yīng)，這已經(jīng)在多種疾病中得到證實(shí)。特別在乙型肝炎，MHCⅠ、MHCⅡ、TNF-α、甘露糖相關(guān)

7、蛋白等基因的SNPs能影響宿主的免疫系統(tǒng)和抗病毒反應(yīng)，從而影響疾病的進(jìn)程（如耐受狀態(tài)，感染慢性化等）和治療反應(yīng)。因此，對(duì)SNPs的研究可以發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎患者對(duì)干擾素治療反應(yīng)的重要因素，從而在預(yù)測(cè)患者可能無(wú)法獲得良好應(yīng)答的情況下，避免不必要的藥物不良反應(yīng)和節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用。
　　 IL28B(interferon-λ3)主要通過(guò)JAK-STAT信號(hào)途徑，誘導(dǎo)磷酸化，上調(diào)干擾素激活相關(guān)基因(IFNstimulatedgenes，I

8、SGs)表達(dá)，產(chǎn)生一些抗病毒蛋白，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。IL28B被認(rèn)為是調(diào)控對(duì)HCV免疫反應(yīng)的關(guān)鍵免疫分子，其基因上一些單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)，特別是SNPrs12979860和SNPrs8099917，已經(jīng)證實(shí)與HCV的自發(fā)清除和治療反應(yīng)高度相關(guān)。HBV與HCV有相類似的免疫機(jī)制，IFN-α和ISGs在宿主抗病毒的反應(yīng)當(dāng)中均具有重要作用。上述SNP位點(diǎn)是否能影響HBV的治療反應(yīng)，值得進(jìn)一步研究。
　　 目的:通過(guò)研究IL

9、28B基因主要SNP(rs12979860和rs8099917)在接受干擾素治療的HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者中的分布規(guī)律，闡明IL28B及其基因與干擾素治療應(yīng)答的關(guān)系，在遺傳背景方面尋找影響干擾素療效的預(yù)測(cè)因素，為慢性乙型肝炎的個(gè)體化治療提供參考依據(jù)，并為深入研究干擾素治療作用的確切機(jī)制提供線索。
　　 方法:采集入組的82例應(yīng)用干擾素治療的患者的外周血（38例對(duì)干擾素應(yīng)答，44例對(duì)干擾素不應(yīng)答）。從外周血中提取全基因組DN

10、A，并擴(kuò)增IL28B基因。SNPrs8099917用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法（PCR-RLFP法）進(jìn)行基因分型，SNPrs12979860通過(guò)直接測(cè)序進(jìn)行基因分型。PCR-RLFP法是基于PCR原理和核酸特異性酶切反應(yīng)原理的一種SNP基因分型方法。具有具有簡(jiǎn)單，快速，經(jīng)濟(jì)，準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)中研究基因變異的一把手術(shù)刀，可以特異性切割所識(shí)別的堿基序列，利用這個(gè)特點(diǎn)，可以檢測(cè)基因片段中某一位點(diǎn)是否存在變異

11、，即可對(duì)某SNP進(jìn)行基因分型。IL28B基因SNPrs8099917對(duì)應(yīng)BsrD1的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，當(dāng)該位點(diǎn)堿基為G時(shí)，存在此內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，而當(dāng)G變異為T后此酶切位點(diǎn)消失，因此，酶切后有3種情況:一是酶切后PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度無(wú)變化，電泳圖譜僅出現(xiàn)1條帶，說(shuō)明此擴(kuò)增片段無(wú)此酶的酶切位點(diǎn)即為TT基因型;二是雜合型，即一條染色體上有此酶的切點(diǎn)，而另一條染色體上的等位基因沒(méi)有此酶切位點(diǎn)，電泳圖譜出現(xiàn)3條帶，即為CG基因型;三是PCR產(chǎn)物

12、被完全切開，電泳圖譜僅出現(xiàn)2條帶，說(shuō)明兩條染色體均有此酶的切點(diǎn)，為純合型，即為GG基因型。在對(duì)SNPrs8099917進(jìn)行基因分型時(shí)，隨機(jī)挑選部分樣本進(jìn)行直接測(cè)序以證實(shí)PCR-RLFP法結(jié)果的可靠性。擴(kuò)增各病例血清中的HBVDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序進(jìn)行基因分型。對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:82例應(yīng)用干擾素治療的HBeAg陽(yáng)性慢乙肝患者的IL28B基因片段均成功擴(kuò)增。對(duì)SNPrs8099917進(jìn)行分型時(shí)，其PCR-RL

13、FP結(jié)果清晰，并能被直接測(cè)序的結(jié)果加以證實(shí);而對(duì)SNPrs12979860進(jìn)行時(shí)，所有片段均直接測(cè)序成功。全部病例HBVDNA均成功擴(kuò)增并成功分型。在干擾素治療應(yīng)答組和非應(yīng)答組，兩者間的基因型均只有B型和C型，構(gòu)成比在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在干擾素治療應(yīng)答組，SNPrs8099917基因型TT,TG+GG的比例分別是81.6％(31/38)和18.4％(7/38)，等位基因G和T的基因頻率是9.2％(7/76)和90.8％(69/76)，

14、在干擾素治療非應(yīng)答組，SNPrs8099917基因型TT,TG+GG的比例分別是97.7％(43/44)，2.3％(1/44)，等位基因G和T的基因頻率分別是1.1％(1/88)和98.9％(87/88)，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(基因型P=0.014;基因頻率P=0.025)。SNPrs12979860位點(diǎn)等位基因C和T的基因頻率在在應(yīng)答組分別為92.1％(70/76)和7.9％(6/76)，在非應(yīng)答組為97.7％(86/88)和2.

15、3％(2/88)，基因型TT+CT和CC的比例在應(yīng)答組分別為15.8％(6/38)和84.2％(32/38)，在非應(yīng)答組為4.5％(2/44)和95.5％(42/44)?；蝾l率和基因型頻率在干擾素治療應(yīng)答組和非應(yīng)答組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:(1)IL28B基因SNPrs8099917的CG+GG基因型頻率和等位基因G的頻率在應(yīng)答組和非應(yīng)答組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)表）。提示G等位基因可能與慢性乙型肝炎患者對(duì)

16、干擾素治療的有效應(yīng)答相關(guān)，提示該SNP位點(diǎn)可能通過(guò)影響IL28B的表達(dá)，后者作用于宿主對(duì)HBV的免疫反應(yīng)，進(jìn)而影響對(duì)干擾素應(yīng)答的個(gè)體反應(yīng)。(2)IL28B是影響HCV自然清楚和治療反應(yīng)的關(guān)鍵免疫分子，但目前尚不清楚IL28B基因如何影響HCV的預(yù)后。盡管HBV有和HCV相近似的免疫機(jī)制，比如一樣對(duì)干擾素治療有反應(yīng)，IL28B在兩者中的機(jī)制是否一樣，尚需進(jìn)一步探討。(3)rs8099917可望成為抗病毒治療中病例選擇和療效預(yù)測(cè)的遺傳學(xué)標(biāo)志

17、。本研究是一個(gè)初步的探討性研究，下一步可通過(guò)擴(kuò)大樣本量來(lái)驗(yàn)證其預(yù)測(cè)作用的大小。(4)SNPrs12979860的基因型頻率和基因頻率在干擾素治療應(yīng)答組和非應(yīng)答組之間并未觀察到有意義的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。目前尚不能否定其意義，因rs12979860位點(diǎn)和rs8099917位點(diǎn)之間存在連鎖不平衡，擴(kuò)大觀察樣本量，或許可進(jìn)一步證實(shí)其所起的作用。(5)鑒于rs8099917與兩種最常見(jiàn)慢性病毒性肝病的相關(guān)性，及其已經(jīng)被證實(shí)的在HCV中的關(guān)鍵作用，rs8