血鏈球菌和-或牙齦卟啉單胞菌對血小板聚集作用的研究.pdf

1、目的：
　　 血鏈球菌(S.sanguinis)和牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)是牙周炎患者口腔中最為常見的兩種病原體,它們的刺激作用能夠激活血小板,并導致血小板聚集和血栓形成；同時有研究表明S.sanguinis和P.gingivalis相互之間可能存在拮抗作用。因此有必要了解S.sanguinis和P.gingivalis單獨或混合菌液促進血小板凝集及其過程中的信號通路,并了解他們之間的相互作用。本研究通過檢測S

2、.sanguinis和P.gingivalis單獨或混合菌液對P-選擇素和纖維蛋白原結合在血小板活化中的表達,以及對血小板聚集的兩條重要信號通路:PI3K通路和MAPK通路的激活下游Akt和MAPK下游p38及Erk磷酸化改變,從而探討其在血小板活化和聚集中的信號通路。
　　 方法：
　　 1、用血小板聚集儀研究S.sanguinis和P.gingivalis單一及混合菌液對血小板聚集所產生的促進作用,比較各組間聚集強度

3、的差異。
　　 2、全血流式細胞儀研究S.sanguinis和P.gingivalis單一及混合菌液對血小板活化過程中P選擇素和纖維蛋白原結合表達的影響,并比較各組間的差異。
　　 3、通過蛋白免疫印痕分析血小板PI3K和MAPK信號通路下游蛋白Akt、p38及Erk的磷酸化程度。
　　 結果：
　　 1、S.sanguinis和P.gingivalis單一及混合菌液對血小板激活的影響:結果顯示S.san

4、guinis菌液組引起血小板聚集的最高聚集率為64.84％±4.27％,P.gingivalis菌液組引起血小板聚集最高聚集率為85.31％±3.50％,S.sanguinis-P.gingivalis菌液組引起血小板聚集的最高聚集率為29.57％±11.24％,對血小板聚集均有促進作用。S.sanguinis-P.gingivalis混合菌液組與單一的S.sanguinis和P.gingivalis菌液組相比明顯降低,有顯著性統(tǒng)計學差

5、異(P<0.01),說明兩種細菌的混合菌液對血小板的刺激和聚集作用明顯較弱。
　　 2、全血流式細胞儀結果顯示:
　　 S.sanguinis組、P.gingivalis組及混合組的纖維蛋白原結合表達率分別為15.42％±2.77％、21.87±4.48％以及11.63％±2.83％；與陰性對照組(2.36％±2.77％)相比,S.sanguinis組和P.gingivalis的單獨及混合菌液都可以明顯增強纖維蛋白原的結

6、合(P<0.01)；而與S.sanguinis菌液組相比,S.sanguinis-P.gingivalis菌液組的纖維蛋白原結合表達率相對較低,但沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；同時,與P.gingivalis菌液組相比,S.sanguinis-P.gingivalis菌液組的纖維蛋白原結合表達率明顯較低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 S.sanguinis組、P.gingivalis組及混合組的P選擇素表達率分別為2

7、1.92％±6.17％、21.78％±2.99％以及10.54％±1.30％。與陰性對照組(3.55％±1.99％)相比,S.sanguinis組、P.gingivalis組及混合組的表達率明顯較高(P<0.01),說明兩種細菌的單一及混合菌液均能明顯刺激血小板P選擇素的表達；與S.sanguinis組相比,S.sanguinis—P.gingivalis菌液組的P選擇素表達率相對較低(P<0.05)；而與P.gingivalis菌液組

8、相比,S.sanguinis-P.gingivalis菌液組的P選擇素表達率明顯較低(P<0.01)；這說明S.sanguinis—P.gingivalis混合菌液組對P選擇素表達的作用相對單一溶液較弱。
　　 3、蛋白免疫印痕結果顯示:
　　 使用兔抗人Akt單克隆抗體,鼠抗人磷酸化Akt(Ser473)單克隆抗體孵育后,可在分子量約為60kD處出現p-Akt磷酸化條帶,其磷酸化強度依次為:P.gingivalis菌液

9、組>S.sanguinis菌液組>S.sanguinis-P.gingivalis混合菌液組
　　 使用兔抗Ap38 MAPK單克隆抗體,鼠抗人磷酸化p38 MAPK(Thr180／Tyr182)單克隆抗體孵育后,可在分子量約為40kD處出現p-p38磷酸化條帶,磷酸化強度依次為:P.gingivalis菌液組>S.sanguinis菌液組>S.sanguinis-P.gingivalis混合菌液組；
　　 使用兔抗人E

10、rk MAPK單克隆抗體,鼠抗人磷酸化Erk MAPK單克隆抗體孵育后,可在分子量約為40kD處出現p-Erk磷酸化條帶,磷酸化強度依次為:P.gingivalis菌液組>S.sanguinis菌液組>S.sanguinis-P.gingivalis混合菌液組。
　　 結論：
　　 本實驗主要探討了血鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌單一或混合菌液刺激血小板活化和聚集的機制。結果顯示:
　　 1、S.sanguinis—P.

11、gingivalis單一和混合菌液能夠導致血小板的聚集作用,且混合組的強度相對較低。
　　 2、S.sanguinis-P.gingivalis單一和混合菌液可以明顯導致較高程度的纖維蛋白原結合及P選擇素的表達,且混合組和單一菌液組的表達程度存在明顯差異。
　　 3、S.sanguinis-P.gingivalis單一和混合菌液可以刺激PI3K和MAPK信號通路的激活,分別表現出其下游蛋白Akt、p38和Erk的磷酸化,