具核梭桿菌對牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌致病作用的影響.pdf

1、目的:牙周炎是多種細菌混合感染所致的口腔炎癥性病變，可以導致牙周支持組織的破壞和牙齒的松動脫落。以往的研究表明，牙周組織的細菌性感染是由口腔菌群和其周圍的上皮細胞相互作用的結果。因此，研究不同種類的牙周致病菌及其宿主細胞之間的互動影響是非常必要的。
　　到目前為止，在齦下菌斑生物膜中發(fā)現(xiàn)至少有300多種不同種類的細菌。齦下細菌的聚集有一定規(guī)律，按照它們的聚集特點以及與牙周狀況的關系，分為6個主要的微生物復合體。與牙周炎關系緊密的牙

2、齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis, Pg)和伴放線聚集桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa)分別為紅色復合體和綠色復合體。然而，他們經(jīng)常在橙色復合體存在的環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)，比如有具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)的微生態(tài)系。Fn是一種有致病潛力的口腔共生菌，其獨特之處是能夠與幾乎所有的口腔細菌發(fā)生共聚，可以作為共聚橋連接早期定植的

3、細菌和晚期定植的細菌。因其具有廣泛的共聚能力被認為在牙菌斑成熟過程中發(fā)揮重要作用，在牙周病變的進展過程中起到了間接的促進作用。此外，有研究表明Fn能夠與Pg和Aa相互影響。
　　與其他感染性疾病相似，致病菌對上皮細胞表面的粘附和隨即發(fā)生的入侵過程是牙周炎發(fā)病的關鍵階段。數(shù)十年以來，致病菌的入侵能力一直被認為是牙周炎的潛在致病因子。由于不同菌種之間的相互作用，Pg、 Aa與Fn的相互共聚、同時感染可能會影響它們對牙齦上皮細胞的粘附和

4、入侵。
　　細菌與其周圍上皮細胞間的相互作用是細菌感染過程中的重要階段，牙齦上皮細胞既是物理性屏障，同時還傳遞細菌信號，是檢測細菌存在的傳感器，維持健康和疾病之間的平衡。在先天性免疫防御機制中，細菌與上皮細胞之間的相互作用可以刺激上皮細胞表達多種免疫反應介質(zhì)。其中，白細胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)是一種強有效的致炎因子，能夠促進中性粒細胞的趨化、激活中性粒細胞并且誘導其增殖。而β-防御素族的人β-防御素2(h

5、umanβ-defensin2，hBD-2)不僅可以吸引單核細胞、促進中性粒細胞的趨化，也能夠激活先天性和獲得性免疫防御。在先天性免疫應答中，橙色復合體中的細菌和紅色復合體中的細菌所產(chǎn)生的功效是不同的，分別歸屬于兩種不同復合體的細菌間的相互影響可能會調(diào)節(jié)IL-8和hBD-2的表達，從而在牙齦組織的免疫調(diào)節(jié)方面產(chǎn)生協(xié)同效應。
　　因此，本研究的目的在于觀察Fn與主要的牙周致病菌Pg、Aa的相互共聚、同時感染對Pg、 Aa粘附和入侵牙

6、齦上皮細胞能力的影響，以及對牙齦上皮細胞IL-8的生成和hBD-2表達的影響。Pg、Aa單獨粘附和入侵牙齦上皮細胞，以及Pg、Aa與Fn相互共聚、同時感染時粘附和入侵牙齦上皮細胞的能力均被檢測。此外，Pg、Aa單獨或與Fn相互共聚、同時感染牙齦上皮細胞時，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和實時熒光定量PCR(real-timePCR，RT-PCR)分別測定牙齦上皮細胞

7、IL-8和hBD-2的表達。
　　方法:1、Pg、Aa單獨或與Fn相互共聚、同時感染時粘附和入侵Ca9-22細胞能力的研究
　　牙齦上皮細胞接種于12孔平底細胞培養(yǎng)板，細胞密度為2.0×105/孔，每孔1ml。在致感染之前，細胞用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate-buffered saline，PBS，pH7.4)洗兩遍，用無抗生素的最小必需培養(yǎng)基（minimal essential medium，MEM）培養(yǎng)2小時。

8、三種不同的菌種接種于腦心浸液肉湯(Sigma, USA)上，補充0.5％的酵母提取物，氯化血紅素(5μg/ml)和維生素K1(5μg/ml)，細菌培養(yǎng)2天直到OD660nm達到1.0。經(jīng)PBS洗過之后，菌細胞懸浮于MEM。細菌懸液(2.0×107/孔)加入鋪滿的單層Ca9-22細胞中，在37℃、5％ CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　在粘附部分的檢測中，細菌與單層Ca9-22細胞孵育1小時，然后單層細胞用PBS洗四遍，去除未粘附的細菌。

9、接下來每孔加入1ml的無菌蒸餾水用于裂解細胞達90分鐘，將溶解產(chǎn)物稀釋1000倍，接種于腦心浸液血瓊脂平板(Brain HeartInfusion agar-Supplemented，BHI-S)，每板100μl菌液，在37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)10天。
　　在入侵部分的檢測中，細菌與單層Ca9-22細胞孵育4小時。在接下來的孵育過程中，單層細胞用PBS洗四遍，去除未粘附的細菌，接種于含200μg/ml甲硝唑和300μg/ml的慶大霉素

10、的MEM中培養(yǎng)1小時，殺滅粘附于細胞外面的細菌。暴露于抗生素之后，單層細胞經(jīng)PBS洗兩遍，用每孔1ml的無菌蒸餾水裂解細胞90分鐘。將溶解產(chǎn)物稀釋100倍，接種于BHI-S血瓊脂平板，每板100μl菌液，在37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)10天。
　　粘附和入侵的微生物所形成的菌落形成單位按照接下來的孵育狀況進行計算，細菌粘附和入侵的能力用細胞溶菌作用后重新獲得的細菌相對于起初加入的細菌總量的百分率表示。
　　2、Pg、Aa單獨或與Fn

11、相互共聚、同時感染Ca9-22細胞時IL-8和hBD-2表達的研究
　　為了檢測Ca9-22細胞所分泌的IL-8的總量，細菌懸液(2.0×107/孔)加入鋪滿Ca9-22的單層細胞中37℃、5％ CO2孵育4小時。然后收集細胞培養(yǎng)液上清，-20℃保存。ELISA定量分析細胞培養(yǎng)液上清中IL-8的濃度，用鼠IL-8單克隆抗體(1∶100，Dako)作為捕獲抗體包被微孔板。重組IL-8或在測試樣品中捕獲的鼠抗體通過加入的兔IL-8多克

12、隆抗體進行檢測，隨即加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶200，Dako)和鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)以及HRP底物2，2'-聯(lián)氮基雙。37℃孵育45分鐘，測試樣品中IL-8的濃度通過已知濃度的重組β溶血性鏈球菌(beta-hemolytic streptococcal，BHS)和IL-8所生成的標準曲線測得。
　　從Ca9-22細胞提取的總RNA（2微克）進行逆轉錄，使用(dT

13、)18和SuperscriptⅡ酶（Invitrogen），反應混合物25微升，42℃反應1小時。在20微升體系中進行實時PCR，反應混合物含有1微升模板cDNA、SYBR Premix Ex Taq、ROXReference Dye（Sigma, USA）和每一種引物（0.2微摩爾）。使用的引物序列是:GAPDH正向引物，5'-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3'和反向引物5'-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3'

14、; hBD-2正向引物5'-AGACTCAGCTCCTGGTCAAGCTC-3'和反向引物5'-TGGCTCCACTCTTAAGGCAGGTA-3'。為了防止擴增出污染的基因組DNA，所有的引物被設計可以擴增至少兩個外顯子。擴增在熒光熱循環(huán)儀(StepOne Plus)中按照以下條件進行:94℃預變性1分鐘，然后是95℃變性15秒、62℃退火15秒和72℃延伸33秒，共40個循環(huán)。通過熔解曲線分析和3％瓊脂糖凝膠檢驗來驗證PCR產(chǎn)物的特

15、異性。在目的基因擴增的同時也擴增管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，使用2-△CT計算相比GAPDH的相對拷貝數(shù)。
　　結果:1、Pg、Aa單獨或與Fn相互共聚、同時感染時粘附和入侵Ca9-22細胞能力的研究
　　Pg、Aa和Fn單獨粘附細胞的能力分別是0.97±0.38％，2.62±0.58％和1.06±0.30％。Pg與Fn相互共

16、聚、同時感染時，Pg粘附Ca9-22的能力被明顯增強至兩倍（P＜0.05）。Aa粘附Ca9-22細胞的能力在Fn存在的狀態(tài)下比A2處理組約升高178.24％(P＜0.05)。這些結果顯示與Fn共同孵育后的Pg、Aa粘附Ca9-22細胞的能力被增強，然而這樣的效果可以被Fn的粘附、入侵抑制劑半乳糖所抑制。
　　Pg、Aa和Fn單獨入侵細胞的能力分別是0.35±0.08％，1.01±0.15％和0.44±0.11％。Pg、 Aa入侵C

17、a9-22細胞的能力在Fn存在的狀態(tài)下比缺乏Fn時分別顯著增強251.43％和207.92％(P＜0.05)。這些結果表明Fn能夠有效增強Pg、Aa入侵Ca9-22細胞的能力，然而這樣的效果可以被半乳糖所抑制。
　　2、Pg、Aa單獨或與Fn相互共聚、同時感染Ca9-22細胞時IL-8和hBD-2表達的研究
　　在單種細菌感染的實驗中，A3處理組中Ca9-22細胞的IL-8產(chǎn)生量最高(428.75pg/ml)，相反的，IL-

18、8產(chǎn)生量最低的為A1處理組(386.66 pg/ml)。在多種細菌感染的實驗中，與A3處理組相比，B1和B2處理組中IL-8的產(chǎn)生量分別降低6.12％和8.05％。而在C1-C4處理組中，IL-8的產(chǎn)生量均比B1-B4處理組輕度升高(P＜0.05)。
　　在單種細菌感染的實驗中，A3處理組中Ca9-22細胞hBD-2 mRNA的表達最高(0.48)，相反的，hBD-2 mRNA表達最低的為A1處理組(0.26)。在多種細菌感染的實

19、驗中，與A3處理組相比，B1和B2處理組中hBD-2 mRNA的表達分別降低66.94％和51.39％。與此同時，在C1-C4處理組中，hBD-2 mRNA的表達均相應的比B1-B4處理組有所升高(P＜0.05)。
　　結論:1、與Fn共聚后，Pg和Aa粘附、入侵牙齦上皮細胞的能力被增強，增強效果可以被半乳糖所抑制。
　　2、與Fn共聚后的Pg和Aa下調(diào)牙齦上皮細胞IL-8的生成和hBD-2的表達，下調(diào)程度可以被半乳糖所抑制