317L型含銅不銹鋼對牙齦卟啉單胞菌抗菌作用的研究.pdf

1、目的:研究317L型含銅不銹鋼(317L-Cu stainless steel，317L-Cu SS)對牙周致病菌——牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)的抑制作用并探討其抗菌機(jī)理，以期開發(fā)一種兼具良好抗菌性和生物相容性的口腔材料，從而預(yù)防口腔治療裝置引起牙齦炎、牙周炎或種植體周圍炎等牙周問題的發(fā)生，拓展不銹鋼在口腔中的應(yīng)用前景。
　　研究方法:1.研究金屬試件在胰酪胨大豆肉湯（Trypticase

2、soy broth，TSB）溶液中Cu離子的釋放情況。將317L SS組和317L-Cu SS組金屬試件浸沒于1 ml TSB溶液中6，12，24，36，48 h，取浸提液以電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Inductively-coupledplasma mass spectrometry，ICP-MS)檢測液體中Cu離子釋放量。2.研究金屬試件對游離態(tài)P.gingivalis的抑制作用。(1)菌落計數(shù)法，將細(xì)菌懸液與金屬試件共培養(yǎng)6，12，

3、24，36，48 h，分別吸取各時間點(diǎn)細(xì)菌懸液稀釋至103 CFU/ml，鋪于TSB血瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)直至形成菌落，計數(shù)菌落數(shù)目以計算抗菌率。(2)絕對實(shí)時定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR），將與金屬試件共培養(yǎng)6，12，24，36，48 h的細(xì)菌懸液吸出，提取細(xì)菌懸液中的總DNA，用熒光定量試劑盒在7500 Real time P

4、CR系統(tǒng)下進(jìn)行DNA的定量檢測。(3)透射電鏡(Transmission electron microscope，TEM)，將與金屬試件共培養(yǎng)24 h的細(xì)菌懸液吸出，分別采用負(fù)染法和超薄切片法，在TEM下觀察細(xì)菌形態(tài)。3.研究金屬試件對其表面P.gingivalis生物膜的抑制作用。(1)掃描電鏡(Scanning electronmicroscope，SEM)，將與細(xì)菌懸液共培養(yǎng)6，12，24，36，48 h的金屬試件以2.5％戊二醛

5、進(jìn)行固定，梯度乙醇溶液脫水后進(jìn)行表面噴金，在SEM下觀察金屬試件表面細(xì)菌生物膜形態(tài)。(2) DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole)染色，將金屬試件與細(xì)菌懸液共培養(yǎng)6，12，24，48 h，采用DAPI熒光染料進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察金屬試件表面細(xì)菌染色情況，反映金屬試件對細(xì)菌繁殖情況的影響。(3)共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscopic，CLSM)，

6、將與細(xì)菌懸液共培養(yǎng)24 h的金屬試件，采用活死細(xì)菌熒光染色試劑盒進(jìn)行染色，在CLSM下觀察金屬試件表面，根據(jù)染色結(jié)果不同表征細(xì)菌活性，用Image J軟件分析金屬試件表面細(xì)菌生物膜中活死細(xì)菌比例;借助NIS-Elements Viewer4.2版軟件重建三維圖像，分析金屬試件表面細(xì)菌生物膜厚度。4.統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用SPSS17.0軟件對計量資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時，均數(shù)采用mean± SD表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，

7、多組間比較采用方差分析，各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.通過ICP-MS檢測在各時間點(diǎn)，317L-Cu SS組Cu離子濃度均高于317LSS組，24 h時317L-Cu SS組Cu離子濃度達(dá)到峰值，約為317L SS組的6倍。2.通過菌落計數(shù)法檢測在共培養(yǎng)6，12，24，36和48 h后，317L-Cu SS組的抗菌率分別為32.70％，57.42％，82.43％，76.72％和100％，并且在各時間

8、點(diǎn)317L-Cu SS組和317L SS組的組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05）。 Real-time qPCR的檢測結(jié)果顯示，隨時間推移，各組細(xì)菌DNA量均增加，空白組細(xì)菌DNA濃度增加最多，317LSS組細(xì)菌DNA濃度增加次之，317L-Cu SS組細(xì)菌DNA濃度增加最少。在24 h、36h和48 h時，317L-Cu SS組細(xì)菌DNA濃度顯著低于317L SS組(P＜0.05）。通過透射電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)，負(fù)染法結(jié)果顯示317LS

9、S組細(xì)菌懸液中細(xì)菌形態(tài)正常，而317L-Cu SS組細(xì)菌懸液中細(xì)菌變形，胞膜皺縮;超薄切片結(jié)果顯示317L SS組細(xì)菌懸液中細(xì)菌形態(tài)正常，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，而317L-Cu SS組細(xì)菌懸液中細(xì)菌形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞壁呈波浪狀，胞周質(zhì)和胞質(zhì)均向外突出，菌毛脫落。3.掃描電鏡的結(jié)果顯示，在各時間點(diǎn)，317L-Cu SS組金屬試件表面的細(xì)菌量明顯少于317L SS組。DAPI染色的結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)12h時，317LSS

10、組金屬試件表面便形成細(xì)菌生物膜，而317L-Cu SS組金屬試件表面僅見稀疏散落細(xì)菌。在各時間點(diǎn)，317L-Cu SS組金屬試件表面細(xì)菌量均明顯低于317L SS組。通過CLSM觀察細(xì)菌活性發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)24 h時，317L SS組金屬試件表面幾乎未見紅色死菌，僅見綠色活菌，而317L-Cu SS組金屬試件表面紅色死菌數(shù)量明顯多于317L SS組，綠色活菌數(shù)量明顯少于317L SS組。用NIS-Elements viewer軟件重建金屬

11、試件表面細(xì)菌生物膜三維結(jié)構(gòu)，317L SS組金屬試件表面細(xì)菌生物膜厚度為36μm，而317L-Cu SS組的厚度僅為20μm。
　　結(jié)論:1.317L-Cu SS中Cu離子的釋放量一直維持在較高水平，利于持續(xù)對P.gingivalis產(chǎn)生抑制作用。2.317L-Cu SS能顯著減少游離態(tài)P.gingivalis數(shù)量。3.317L-Cu SS能明顯降低黏附其表面的P.gingivalis數(shù)量，并抑制細(xì)菌生物膜形成。4.含銅量為4.5