Notch1途徑在喉鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關調控機制的研究.pdf

1、喉癌(laryngocarcinoma)是耳鼻咽喉科常見惡性腫瘤,其發(fā)病率約占全身腫瘤的1～5％,在耳鼻喉科領域中僅次于鼻咽癌和鼻腔癌、鼻竇癌,居第三位。喉癌的病因不明,可能與長期過度煙、酒、有害化學氣體刺激有關。喉癌約占喉惡性腫瘤的98.1％,其中喉鱗狀細胞癌占85-90％,腺癌約占2％,其余為肉瘤。喉癌和其它腫瘤一樣,是一種多基因,多步驟,多階段的發(fā)生過程,發(fā)病機制復雜,治療困難。自20世紀80年代以來,喉癌的治療取得了較大的進展,

2、手術、放療、化療和免疫治療的聯(lián)合應用,大大提高了患者5年的生存率。但手術、放療和化療引起的并發(fā)癥多,毒副作用大,因此利用分子生物學技術從分子水平研究喉癌的發(fā)病機理并尋找治療喉癌的分子靶點顯得十分迫切。
　　 Notch基因于1919年在果蠅體內發(fā)現(xiàn),當時的研究發(fā)現(xiàn)如果該基因的部分功能缺失則會在果蠅翅膀的邊緣造成一些缺刻(notches),這也正是Notch基因命名的由來。目前,Notch1信號途徑是動物細胞中研究最為廣泛的信號途

3、徑之一,顯示出良好的臨床應用前景,是許多重要細胞信號途徑的交匯點,提示該信號途徑在腫瘤的發(fā)生中具有重要的地位。陸續(xù)的研究表明,Notch1廣泛表達于多個不同的物種中,其家族成員的結構具有高度的保守性,在個體系統(tǒng)發(fā)育、細胞命運決定、不同細胞的分化、模式形成、腫瘤的發(fā)生以及神經退行性疾病等生理病理過程中起著關鍵作用。目前,Notch1與腫瘤之間關系的報道日益增多,其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用,包括:乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、胰腺癌、

4、前列腺癌、腦癌以及食管癌等。此外,Notch1信號途徑在不同的腫瘤中的作用不完全相同,有時甚至在同一種腫瘤的不同時期作用也不盡相同,最具有典型代表的是宮頸癌組織中的研究,其結果表明,Notch1在宮頸癌發(fā)生的早期階段表現(xiàn)為促癌作用,而晚期階段表現(xiàn)為抑癌作用,這些研究提示Notch1在不同類型的腫瘤中其表達和功能存在明顯的差異,這可能是由于Notch1途徑自身的復雜性所決定的。
　　 盡管目前Notch1信號途徑的研究與日俱增,其

5、重要性也十分明顯,然而迄今為止,國內外均未見Notch1信號途徑在喉鱗狀細胞癌中作用的研究報道,因此作者提出疑問,是否Notch1信號途徑在喉鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展中也起著十分重要的作用?為了解決這個問題,在本研究中,作者首先通過Real-time PCR、Western blotting以及免疫組織化學方法檢測喉鱗狀細胞癌組織和聲帶息肉組織中Notch1和下游靶基因Hes1的表達,并分別分析Notch1和Hes1的表達與喉鱗狀細胞癌的臨

6、床病理學參數之間的關系,初步探討Notch1和Hes1在喉鱗狀細胞癌中的可能作用。進一步,構建Notch1胞內結構域(Notch intracellulardomain,NICD)逆轉錄病毒載體和綠色熒光蛋白真核表達載體,并篩選出穩(wěn)定表達NICD的Hep-2細胞株,通過半定量RT-PCR和Western blotting方法檢測Notch1和Hes1的表達,接著通過綠色熒光蛋白觀察Notch1 NICD所表達的蛋白在Hep-2細胞中的定

7、位,從而探討外源的Notch1 NICD是否能激活Hep-2細胞中的Notch1信號途徑。最后,作者通過CCK-8細胞增殖實驗、流式細胞術、Boyden chamber實驗、半定量RT-PCR和Western blotting技術研究活化的Notch1信號途徑對細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡以及細胞的遷移能力的影響,并探討相關的分子機制。該研究旨在為以Notch1信號途徑為靶點的喉鱗狀細胞癌的分子靶向治療提供可行性的臨床依據。
　　

8、 第一部分 Noteh1及其下游靶基因Hes1在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及其意義
　　 方法：
　　 (1)采用Real-time PCR方法檢測新鮮標本喉鱗狀細胞癌組織和聲帶息肉組織中Notch1和下游靶基因Hes1 mRNAs的相對表達水平。
　　 (2)采用Western blotting方法檢測新鮮標本喉鱗狀細胞癌組織和聲帶息肉組織中Notch1和下游靶基因Hes1蛋白的相對表達水平。
　　 (

9、3)采用免疫組織化學方法檢測67例喉鱗狀細胞癌組織和26例聲帶息肉組織中Notch1和Hes1蛋白的表達。
　　 (4)統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0分析軟件,統(tǒng)計學數據用均數±標準差((x)±s)表示,采用X2檢驗、t檢驗和方差分析。P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 (1)Real-time PCR和 Western blotting的結果均顯示,Notch1和Hes1在聲帶息肉組織中的表

10、達均明顯高于喉鱗狀細胞癌組織中的表達(P<0.05)。
　　 (2)Notch1蛋白的表達主要定位于細胞質,部分見于細胞核,Hes1蛋白的表達主要定位于細胞核。聲帶息肉組織中Notch1和Hes1蛋白表達的陽性率顯著高于喉鱗狀細胞癌組織中Notch1和Hes1蛋白表達的陽性率,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 (3)Notch1和Hes1蛋白的表達與喉鱗狀細胞癌的組織學分化、腫瘤TNM分期及淋巴結轉移有關(P

11、<0.05),且分化程度越低,Notch1和Hes1蛋白的表達越低。
　　 第二部分 Noteh1胞內結構域逆轉錄病毒載體的構建及功能初步研究
　　 方法：
　　 (1)Notch1胞內結構域(Notchl NICD)全長的克隆及測序鑒定:用Trizol試劑從人胎盤組織中提取總RNA,然后合成cDNA第一鏈,以合成的cDNA為模板通過PCR擴增Notch1胞內結構域全長,并測序。
　　 (2)pCLXSN

12、-Notch1和 pEGFP-C1-NICD載體的構建:將帶酶切位點的NICD片段分別和逆轉錄病毒載體pCLXSN和綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-C1相連,構建pCLXSN-Notch1和pEGFP-C1-NICD載體。
　　 (3)穩(wěn)定表達NICD的Hep-2細胞株的篩選:將病毒上清和polybrene混勻加入培養(yǎng)的Hep-2細胞中,利用G418(400μg/ml)的培養(yǎng)液進行篩選培養(yǎng),直到篩選出穩(wěn)定表達有NICD的He

13、p-2細胞株。
　　 (4)穩(wěn)定表達株的鑒定:利用半定量RT-PCR和Western blotting技術檢測Notch1和下游靶基因Hes1 mRNAs和蛋白的相對表達。
　　 (5)利用熒光顯微鏡觀察轉染pEGFP-C1-NICD載體后蛋白的定位及研究Notch1途徑在喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2中的激活狀態(tài)。
　　 (6)統(tǒng)計學處理:半定量RT-PCR和Western blotting的結果應用Gene T

14、ools進行灰度值分析,上述實驗均分別重復三次。應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,統(tǒng)計學數據用均數±標準差((x)±s)表示,兩樣本均數比較采用t檢驗,多個樣本均數比較應用單因素方差分析(One-wayANOVA),P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 (1)成功構建了Notch1 NICD的逆轉錄病毒載體pCLXSN-Notch1和綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-C1-NICD。
　

15、　 (2)通過逆轉錄病毒載體pCLXSN-Notch1載體轉染喉鱗癌細胞系Hep-2,成功篩選出穩(wěn)定表達Notch1 NICD的喉鱗癌細胞株。
　　 (3)RT-PCR結果顯示,穩(wěn)定表達Notch1 NICD的喉鱗癌細胞株的Notch1和Hes1 mRNAs的表達均明顯上調。
　　 (4)Western blotting結果表明,穩(wěn)定表達Notch1 NICD的喉鱗癌細胞株的Notch1和Hes1蛋白的表達均明顯上調。

16、
　　 (5)NICD的引入能明顯提高Notch1信號途徑的下游靶基因Hes1 mRNA和蛋白的表達水平,提示外源性的NICD能夠激活Hep-2細胞中的Notch1信號途徑。
　　 (6)轉染NICD的綠色熒光蛋白載體后,能明顯見到綠色熒光主要在喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2的細胞核部分表達,進一步提示Notch1途徑處于激活狀態(tài)。
　　 第三部分上調Notch1對喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的細胞生物學行為影響的研

17、究
　　 方法：
　　 (1)采用新型的CCK-8增殖實驗分析激活的Notch1信號途徑對喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖能力的影響。
　　 (2)運用流式細胞術檢測激活的Notch1信號途徑對喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞周期及細胞凋亡的影響。
　　 (3)采用Boyden chamber實驗分析上調Notch1的表達對喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2細胞遷移能力的影響。
　　 (4)采用半定量RT-PCR

18、和Western blotting方法檢測與細胞周期、細胞凋亡以及細胞遷移相關基因表達的變化。
　　 (5)統(tǒng)計學處理:半定量RT-PCR和Western blotting的結果應用Gene Tools進行灰度值分析,上述實驗均分別重復三次。應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,統(tǒng)計學數據用均數±標準差((x)±s)表示,兩樣本均數比較采用t檢驗,多個樣本均數比較應用單因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.0

19、5表示具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 (1)活化的Notch1信號途徑能明顯地抑制喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2細胞的增殖。
　　 (2)活化的Notch1信號途徑能明顯地促使喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2細胞靜止在G0/G1期,細胞周期相關基因cyclin D1,cyclin E和cdk2表達下調而p53表達上調。
　　 (3)活化的Notch1信號途徑能明顯誘導喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2細胞發(fā)生凋

20、亡,細胞凋亡相關基因caspase-3和caspase-9表達上調而Bcl-2表達下調。
　　 (4)活化的Notch1信號途徑能降低喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2細胞的遷移能力,細胞遷移相關基因基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9表達下調。
　　 結論：
　　 (1)Notch1在喉鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用。
　　 (2)Notch1的過表達能明顯促使細胞周期靜止、誘導細胞凋亡以及抑制