Wnt信號通路對人骨髓間充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化作用的研究.pdf

1、[目的]
　　 構(gòu)建雙表達基因慢病毒載體pLV.EX3d.P/puro-EF1A>WNT3a>IRES/eGFP，用攜帶目的基因Wnt-3a及示蹤基因eGFP的慢病毒轉(zhuǎn)導人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)，建立能夠持續(xù)激活Wnt信號通路的體外細胞模型，觀察其對hBMSCs神經(jīng)分化的影響。
　　 [方法]
　　 密度梯度離心加差速貼壁

2、法體外分離和純化hBMSCs，原代培養(yǎng)2周后傳代。觀察細胞形態(tài)特征，繪制生長曲線，觀察成骨、成脂及成軟骨誘導，流式細胞儀鑒定其表面抗原。
　　 基于GatewayTM技術(shù)構(gòu)建雙表達慢病毒載體pLV.EX3d.P/puro-EF1A>WNT3a>IRES/eGFP，經(jīng)293FT包裝并釋放出病毒，將其轉(zhuǎn)導hBMSCs。
　　 設(shè)置轉(zhuǎn)導組、未轉(zhuǎn)導組以及對照組，采用bFGF以及抗氧化劑BHA聯(lián)合誘導方案，誘導hBMSCs神經(jīng)分化

3、，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。RT-PCR法分別測定神經(jīng)誘導前，誘導3h，誘導6h，誘導后維持培養(yǎng)24h不同時點中Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β的mRNA表達水平。免疫熒光細胞化學技術(shù)(IFC)觀察Wnt-3a對hBMSCsβ-catenin亞細胞分布的影響；測定神經(jīng)細胞特異性標志物Nestin，NSE，NF，beta-Ⅲ Tubulin，GFAP的不同時點表達水平變化規(guī)律。觀察激活Wnt信號通路后對hBMSCs神經(jīng)分

4、化的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 密度梯度離心和差速貼壁法分離、純化培養(yǎng)的hBMSCs呈梭狀，具有均質(zhì)性好，細胞增殖活力強、傳代生長快的特點。本實驗培養(yǎng)的hBMSCs生長曲線呈S形，且P5細胞活性較好；成骨誘導13天，茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，成脂誘導7天，油紅。染色呈橙紅色，成軟骨誘導21天，阿利新藍染色可見大多數(shù)細胞呈現(xiàn)天藍色，胞質(zhì)內(nèi)可見深染顆粒；流式細胞儀檢測hBMSCs表面抗原，結(jié)果顯示CD29、CD44、CD105

5、陽性，CD34、CD45陰性。
　　 經(jīng)測序證實目的基因Wnt-3a及示蹤基因eGFP片段按正確方向重組入目的載體中，雙表達慢病毒載體pLV.EX3d.P/puro-EF1A>WNT3a>IRES/eGFP在293FT細胞中包裝成功，獲得成熟的病毒顆粒，測得病毒滴度為4.25×107TU/ml。用含Wnt-3a/eGFP的病毒上清分別以不同MOI轉(zhuǎn)導hBMSCs，結(jié)果表明MOI2.0組的轉(zhuǎn)導效果最好。RT-PCR證實hBMSCs

6、-Wnt3a過表達wnt-3a。
　　 神經(jīng)誘導后大部分細胞表現(xiàn)為富有突起的錐狀細胞，突起延伸交織成網(wǎng)，細胞生長狀況良好。相對于未轉(zhuǎn)導組，轉(zhuǎn)導組細胞出現(xiàn)出現(xiàn)軸突二級分支及典型神經(jīng)元樣細胞形態(tài)的時間較早，從神經(jīng)元樣細胞總體數(shù)量上看，轉(zhuǎn)導組也優(yōu)于未轉(zhuǎn)導組，但生長狀態(tài)與未轉(zhuǎn)導組基本相同。對照組細胞形態(tài)無改變。
　　 RT-PCR檢測Wnt-3a、GSK-3β、β-catenin的mRNA表達水平，結(jié)果表明：在神經(jīng)誘導的條件下，

7、轉(zhuǎn)導組Wnt-3a的表達持續(xù)增強，誘導后維持培養(yǎng)24h達到高峰。與之相對應(yīng)，GSK-3β的表達逐漸下調(diào)，β-catenin則逐漸上調(diào)。IFC檢測結(jié)果表明：hBMSCs-Wnt3a在神經(jīng)誘導的過程中存在β-catenin胞內(nèi)積聚及核內(nèi)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，表明成功激活經(jīng)典Wnt信號通路；同時顯示，隨著誘導進程的推移，神經(jīng)干細胞表面標志Nestin逐漸下調(diào)，神經(jīng)元樣細胞表面標志NSE，NF，beta-Ⅲ Tubulin表達明顯增強，星形膠質(zhì)細胞表面標

8、志GFAP也有所增加。相對于未轉(zhuǎn)染組，這種變化更為明顯，提示W(wǎng)nt信號通路能夠有效促進hBMSC神經(jīng)分化。
　　 [結(jié)論]
　　 建立了穩(wěn)定的hBMSCs分離培養(yǎng)體系，攜帶目的基因Wnt-3a及示蹤基因增強型綠色熒光蛋白(eGFP)的慢病毒可以穩(wěn)染人hBMSCs，構(gòu)建了能夠持續(xù)激活Wnt信號通路的體外細胞模型。聯(lián)合誘導方案可體外誘導hBMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞以及神經(jīng)膠質(zhì)細胞，PT-PCR及IHC結(jié)果提示W(wǎng)nt-3a激