紫杉醇誘導細胞凋亡過程中JNK信號通路的作用及NF-κBp65蛋白表達的變化.pdf

1、目的:紫杉醇(Paclitaxel)[1]是目前廣泛應用于臨床的抗癌藥物，主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌等也都有一定療效。但是，它在臨床使用過程中表現(xiàn)出一種劑量依賴的藥物毒性[2]，主要包括神經(jīng)毒性[3]和骨髓抑制[4]，其中神經(jīng)毒性包括中樞性神經(jīng)毒性和周圍性神經(jīng)毒性，但其發(fā)病機制及治療方法尚不明確。因此本研究通過探討紫杉醇中樞性神經(jīng)毒性的分子機制，為臨床預防和治療提供理論依據(jù)。
　　研究表明，紫杉醇誘發(fā)神經(jīng)痛的細胞學和

2、分子生物學機制主要是細胞凋亡引起小膠質細胞絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路的激活[5]。MAPKs通路之一JNK（C-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路的生理作用主要表現(xiàn)為介導炎癥和細胞凋亡，其下游轉錄因子NF-κB在海馬區(qū)域有豐富表達。另一研究發(fā)現(xiàn)，炎性介質可通過反饋途徑活化NF-κB，進而放大炎癥反應，上調NF-κB的表達，誘發(fā)細胞凋亡。給予NF-κB表達抑制劑后，其下游因子IL-1β、TNF-α等釋放

3、減少，可抑制大腦神經(jīng)元細胞損傷及凋亡。但在紫杉醇誘導海馬神經(jīng)元細胞凋亡過程中JNK信號通路的調控機制及其下游因子NF-κBp65的作用尚不清楚。本研究通過無血清體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元并采用β-tublinⅢ免疫熒光細胞化學法對海馬神經(jīng)元進行鑒定。神經(jīng)元培養(yǎng)成功后給予不同濃度及不同作用時間的紫杉醇，采用MTT法（n=3，(x)±s）測定紫杉醇誘導海馬神經(jīng)元凋亡的最適濃度，以制備紫杉醇誘導海馬神經(jīng)元凋亡模型。模型制備成功后，給予紫杉

4、醇、JNK抑制劑SP600125進行干預。實驗分為:完全空白對照組（不添加任何藥物，C組）、JNK抑制劑空白對照組（只添加JNK抑制劑SP600125，S組）、紫杉醇空白對照組（只添加紫杉醇，N組）、JNK抑制劑+紫杉醇組（S+N組）。采用流式細胞技術、Western-blot法比較各組海馬神經(jīng)元細胞凋亡率的變化及NF-κ Bp65蛋白表達的變化，從而探討JNK信號通路對紫杉醇誘導體外培養(yǎng)新生SD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的調控作用及其下游因子

5、NF-κBp65蛋白表達的變化。
　　方法:健康清潔級新生24h內SD大鼠，由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供，斷頭處死，分離海馬神經(jīng)元，將其接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)至第5d，采用β-tublinⅢ免疫熒光細胞化學法鑒定海馬神經(jīng)元是否培養(yǎng)成功。將終濃度約為1×106個/ml的細胞懸液按每孔200μl接種于多聚賴氨酸包被好的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)5d后，隨機分為5組:正常對照組和四組加入不同濃度紫杉醇組(終濃度分別為0.01μmol/L，0.1μ

6、mol/L，1μmol/L，10μmol/L)，每組6個復孔，分別在給藥第12、24、48、72小時后加入5mg/ml的MTT20μl。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加入DMSO150μl，置于37℃恒溫水浴搖床中震蕩混勻10min。用酶標儀在490nm波長處測定其吸光值，觀察不同紫杉醇濃度、不同作用時間對海馬神經(jīng)元存活率的影響，以確定紫杉醇誘導海馬神經(jīng)元凋亡的最適濃度，制備紫杉醇誘導海馬神經(jīng)元凋亡模型。
　　采用隨機數(shù)字表法，將培養(yǎng)至第5

7、d，濃度約為1×106個/ml的海馬神經(jīng)元分為四組:完全空白對照組（不添加任何藥物，C組）、JNK抑制劑空白對照組（只添加JNK抑制劑SP600125，S組）、紫杉醇空白對照組（只添加紫杉醇，N組）、JNK抑制劑+紫杉醇組（S+N組）。采用流式細胞技術測定各組海馬神經(jīng)元凋亡率的變化。采用Western-blot法測定各組NF-κBp65蛋白表達的變化。
　　結果:1海馬神經(jīng)元胞體呈錐形、三角形或梭形，具有一個較長的軸突，1～2個樹

8、突，交叉密集成網(wǎng)狀，培養(yǎng)至第5d，細胞純度達到90％，說明海馬神經(jīng)元培養(yǎng)成功。2紫杉醇對海馬神經(jīng)元存活率的抑制作用具有時間和濃度的交互作用(F=6.005，P＜0.05):當給予相同濃度的紫杉醇作用不同時間時，隨著作用時間的延長，細胞存活率逐漸降低(F=6，151，P＜0.05);而給予不同濃度的紫杉醇作用相同時間時，隨著濃度的增高，細胞的存活率也逐漸降低（F=11.825，P＜0.05）。1μmol/L紫杉醇處理24h后可抑制海馬神經(jīng)

9、元，達到有效半數(shù)抑制率，IC50=1，故本實驗選擇1μmol/L為紫杉醇誘導海馬神經(jīng)元凋亡的最適濃度，處理時間為24h，該條件可成功制備紫杉醇誘導海馬神經(jīng)元凋亡模型，適用于進一步的實驗研究。3與C組相比，N組細胞凋亡率升高，NF-κBp65蛋白表達上調(P＜0.05)，而S組細胞凋亡率明顯降低，NF-κBp65蛋白表達下調（P＜0.05）;與N組相比，S+N組細胞凋亡率有下降趨勢，NF-κBp65蛋白表達下調（P＜0.05)。