紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中JNK信號通路的作用及NF-κBp65蛋白表達(dá)的變化.pdf

1、目的:紫杉醇(Paclitaxel)[1]是目前廣泛應(yīng)用于臨床的抗癌藥物，主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌等也都有一定療效。但是，它在臨床使用過程中表現(xiàn)出一種劑量依賴的藥物毒性[2]，主要包括神經(jīng)毒性[3]和骨髓抑制[4]，其中神經(jīng)毒性包括中樞性神經(jīng)毒性和周圍性神經(jīng)毒性，但其發(fā)病機(jī)制及治療方法尚不明確。因此本研究通過探討紫杉醇中樞性神經(jīng)毒性的分子機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
　　研究表明，紫杉醇誘發(fā)神經(jīng)痛的細(xì)胞學(xué)和

2、分子生物學(xué)機(jī)制主要是細(xì)胞凋亡引起小膠質(zhì)細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路的激活[5]。MAPKs通路之一JNK（C-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路的生理作用主要表現(xiàn)為介導(dǎo)炎癥和細(xì)胞凋亡，其下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在海馬區(qū)域有豐富表達(dá)。另一研究發(fā)現(xiàn)，炎性介質(zhì)可通過反饋途徑活化NF-κB，進(jìn)而放大炎癥反應(yīng)，上調(diào)NF-κB的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。給予NF-κB表達(dá)抑制劑后，其下游因子IL-1β、TNF-α等釋放

3、減少，可抑制大腦神經(jīng)元細(xì)胞損傷及凋亡。但在紫杉醇誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過程中JNK信號通路的調(diào)控機(jī)制及其下游因子NF-κBp65的作用尚不清楚。本研究通過無血清體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元并采用β-tublinⅢ免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法對海馬神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。神經(jīng)元培養(yǎng)成功后給予不同濃度及不同作用時間的紫杉醇，采用MTT法（n=3，(x)±s）測定紫杉醇誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的最適濃度，以制備紫杉醇誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡模型。模型制備成功后，給予紫杉

4、醇、JNK抑制劑SP600125進(jìn)行干預(yù)。實驗分為:完全空白對照組（不添加任何藥物，C組）、JNK抑制劑空白對照組（只添加JNK抑制劑SP600125，S組）、紫杉醇空白對照組（只添加紫杉醇，N組）、JNK抑制劑+紫杉醇組（S+N組）。采用流式細(xì)胞技術(shù)、Western-blot法比較各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率的變化及NF-κ Bp65蛋白表達(dá)的變化，從而探討JNK信號通路對紫杉醇誘導(dǎo)體外培養(yǎng)新生SD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用及其下游因子

5、NF-κBp65蛋白表達(dá)的變化。
　　方法:健康清潔級新生24h內(nèi)SD大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，斷頭處死，分離海馬神經(jīng)元，將其接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)至第5d，采用β-tublinⅢ免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定海馬神經(jīng)元是否培養(yǎng)成功。將終濃度約為1×106個/ml的細(xì)胞懸液按每孔200μl接種于多聚賴氨酸包被好的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)5d后，隨機(jī)分為5組:正常對照組和四組加入不同濃度紫杉醇組(終濃度分別為0.01μmol/L，0.1μ

6、mol/L，1μmol/L，10μmol/L)，每組6個復(fù)孔，分別在給藥第12、24、48、72小時后加入5mg/ml的MTT20μl。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加入DMSO150μl，置于37℃恒溫水浴搖床中震蕩混勻10min。用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其吸光值，觀察不同紫杉醇濃度、不同作用時間對海馬神經(jīng)元存活率的影響，以確定紫杉醇誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的最適濃度，制備紫杉醇誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡模型。
　　采用隨機(jī)數(shù)字表法，將培養(yǎng)至第5

7、d，濃度約為1×106個/ml的海馬神經(jīng)元分為四組:完全空白對照組（不添加任何藥物，C組）、JNK抑制劑空白對照組（只添加JNK抑制劑SP600125，S組）、紫杉醇空白對照組（只添加紫杉醇，N組）、JNK抑制劑+紫杉醇組（S+N組）。采用流式細(xì)胞技術(shù)測定各組海馬神經(jīng)元凋亡率的變化。采用Western-blot法測定各組NF-κBp65蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:1海馬神經(jīng)元胞體呈錐形、三角形或梭形，具有一個較長的軸突，1～2個樹

8、突，交叉密集成網(wǎng)狀，培養(yǎng)至第5d，細(xì)胞純度達(dá)到90％，說明海馬神經(jīng)元培養(yǎng)成功。2紫杉醇對海馬神經(jīng)元存活率的抑制作用具有時間和濃度的交互作用(F=6.005，P＜0.05):當(dāng)給予相同濃度的紫杉醇作用不同時間時，隨著作用時間的延長，細(xì)胞存活率逐漸降低(F=6，151，P＜0.05);而給予不同濃度的紫杉醇作用相同時間時，隨著濃度的增高，細(xì)胞的存活率也逐漸降低（F=11.825，P＜0.05）。1μmol/L紫杉醇處理24h后可抑制海馬神經(jīng)

9、元，達(dá)到有效半數(shù)抑制率，IC50=1，故本實驗選擇1μmol/L為紫杉醇誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的最適濃度，處理時間為24h，該條件可成功制備紫杉醇誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡模型，適用于進(jìn)一步的實驗研究。3與C組相比，N組細(xì)胞凋亡率升高，NF-κBp65蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，而S組細(xì)胞凋亡率明顯降低，NF-κBp65蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）;與N組相比，S+N組細(xì)胞凋亡率有下降趨勢，NF-κBp65蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05)。