利用siRNA抑制NF-κBp65蛋白的表達(dá)對Ⅱ型血管內(nèi)皮細(xì)胞激活的影響的研究.pdf

1、器官移植現(xiàn)在已經(jīng)成為治療終末期器官功能衰竭的有效手段，為緩解臨床同種供體的不足，異種器官作為最可能的供體來源越來越受到重視。然而，異種器官移植作為遠(yuǎn)緣移植，其面臨的排斥反應(yīng)較同種移植更為強(qiáng)烈、復(fù)雜。目前，異種移植面臨的主要障礙是延遲性排斥反應(yīng)，在這一過程中，由誘生抗體誘導(dǎo)的移植物Ⅱ型血管內(nèi)皮細(xì)胞激活是異種移植物功能喪失的關(guān)鍵。本課題利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)特異性的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中核因子κB(NF-κB)的表達(dá)，研究小干擾RNA(

2、siRNA)對異種移植延遲性排斥反應(yīng)中Ⅱ型血管內(nèi)皮細(xì)胞激活的抑制作用，探討RNA干擾技術(shù)在異種器官移植中的應(yīng)用前景。　　方法：　　1.將昆明小鼠(體重20-25g)頸椎脫臼處死，無菌狀態(tài)下完整取出其胸、腹主動脈，利用植塊法在含有20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行小鼠動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和生長特性，進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞中Ⅷ因子相關(guān)抗原的檢測鑒定?！　?.設(shè)計(jì)并體外化學(xué)合成小鼠NF-κBp

3、65的siRNA；同時篩選對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞(EOMA)有較高轉(zhuǎn)染效率的轉(zhuǎn)染試劑，并進(jìn)一步優(yōu)化該轉(zhuǎn)染試劑在轉(zhuǎn)染小鼠NF-κBp65的siRNA時的轉(zhuǎn)染條件?！　?.將EOMA細(xì)胞分為四組：(1)空白對照組(細(xì)胞內(nèi)不加任何干擾因素)；(2)陰性對照組(脂質(zhì)體不攜帶siRNA)；(3)NF-κBsiRNA組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染NF-κBsiRNA)；(4)scramblesiRNA組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染scramblesiRNA)。于轉(zhuǎn)染前一天，在24孔板中